【仪表网 行业聚焦点】在光学领域，像差问题的存在影响着该领域的技术应用。像差会使光波前发生形变，降低成像的信噪比和分辨率，甚至产生赝像或无法获得有意义的图像，该问题特别对双光子成像影响严重。因此解决像差问题，实现活体，例如小鼠大脑皮层深层区域的高质量成像成为光学成像发展中亟待解决的课题。
荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
像差问题一直困扰着光学领域的工作者。像差会使光波前发生形变，不仅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多时候我们只能“雾里看花”，更甚者，产生赝像，或无法获得有意义的图像。像差问题对双光子成像的影响尤为严重，因为在那里，荧光信号对入射光强度的依赖是平方关系，一旦入射光波前形变，不仅聚焦强度大幅下降，成像分辨率也急剧恶化。因此，如何解决像差问题，实现活体，例如小鼠大脑皮层，深层区域的高质量成像成为光学成像发展中具挑战性的问题之一。
近日，来自美国霍华德·休斯医学研究所的研究者与来自中科院上海光机所的研究人员合作，成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研发成功一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正活体小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，大大改进了成像质量，使得原来在活体鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见。这一新的自适应光学方法，使得在活体小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。
在该自适应光学双光子荧光显微镜中，研究者将空间光位相调制器光学共轭到显微物镜的后焦平面，通过位相调制器将入射光分成若干子区域，每一块子区域的波前都可以被独立控制。同时，利用数字微阵列光处理器，以不同的频率同时调制其中一半子区域的入射光强度，以另一半子区域作为“参考波前”。来自所有子区域光束会在焦点处会聚干涉，通过监测焦点激发的双光子信号随时间的变化情况，并进行傅里叶变换分析，可以“分解”得到被调制的每一块子区域的“光线”的贡献信息，从而可以实现对一半子区域波前的并行测量。对另一半子区域重复这一测量过程，从而获得整个入射波前的信息并进行校正。
将高清晰图像与使用简便的系统，以及广泛的宽视野显微镜应用相结合。研究者使用该显微镜除了可以完成从高速成像到TIRF的日常试验之外，还可以获得超清的影像。独特的全内反射荧光功能可在多色实验过程中，通过改变波长以智能方式弥补穿透深度，对消散的视野方向进行全自动校准和选择，以确保获得质量佳的全内反射荧光图像与可靠的实验数据。动态扫描仪可定位激光束，并决定消散视野的准确穿透深度。使用一些特殊的荧光软件如徕卡AF7000荧光软件可全面控制全内反射荧光系统，包括校准与所有显微镜功能，确保减少培训的时间以尽快投入到科学研究中。
该方法耗时很短，通常约1~3分钟左右即可完成像差的测量和校正，无需复杂的计算，适用于任何标记密度和标记类型的样品。更重要的是，得到的像差校正图案可以用于提高较大视场范围内的成像质量。该方法无疑为在体研究小鼠大脑皮层深层区域的生物、医学问题提供了可行性方案。
