水分是药品常用的检测项目, 常应用于原料药或其制剂的检查, 在药品检测领域有着广泛的应用, 已为各国药典广泛收载。检测实验室进行水分测定的水平可以客观地、较有代表性地反映出该实验室的药品检测能力。药品中水分测定的影响因素较多, 如费休氏试液的标定液滴定度的影响、溶剂用量及溶解时间的影响、称样量的影响、滴定仪器的影响等, 需要较高的技术能力^[1]。

能力验证是实验室质量保证体系中的一个重要组成部分。参加能力验证活动是评价实验室检测水平, 锻炼人员技术能力, 促进实验室认可和交流的重要手段^[2]。我国在检测和校准实验室的国家认可制度中对实验室参加能力验证并取得满意结果提出了明确的要求^[3]。

本次研究通过组织药品中水分测定的能力验证计划可以使参加实验室了解国内药品及其他相关检测领域的整体水平, 为这些领域的管理和CNAS的认可提供信息;同时也可以使参加实验室识别实验室间存在的差异, 促进实验室共同提高水平;CNAS也可以通过比对, 发现、分析并解决问题, 监控认可实验室检测能力的维持情况^[7,8,9,10]。检测方法参照中国药典2010年版二部附录ⅧM, “水分测定法”法 (费休氏法) , A (容量滴定法) 测定水分。

鉴于药品水分的质量控制要求, 本研究对国内166家药品、兽药等检测机构的药品水分测定能力进行测试, 研究水分测定能力验证的样品制备、均匀性与稳定性、结果统计、能力评价等情况, 并对测试结果进行讨论。

1 仪器与试药

厦门群隆卡氏水分仪  ;无水甲醇 (分析纯, ) ;费休氏试液 (分析纯, ) ;纯化水。样品来源为市售进口品牌 (Fluka试剂) 分析纯试剂。

2 方法

2.1 测试样品制备

本次能力验证研究采用单一样品设计, 样品为酒石酸二钠二水合物, 该物质不吸水, 也不失水, 具有良好的稳定性, 美国药典作为标化费休氏滴定液的标准物质或用于水分测定的质控物质。在温度为 (25±2) ℃、相对湿度≤50%的环境下, 将样品分装到透明玻璃瓶中, 用铝盖压紧密封。共制备样品250瓶, 每瓶装量约为1.0 g。分装后的样品按照单盲样品分配表分配, 向每个参加者提供1份白色粉末样品。

2.2 样品均匀性和稳定性检验

在所有样品中, 以随机方式抽取10瓶样品用于均匀性检验, 对于抽取的每瓶样品, 在重复性条件下测试3次。检测方法参照中国药典2010年版二部附录ⅧM, “水分测定法”法 (费休氏法) , A (容量滴定法) 测定水分。

取完整包装的样品各6瓶, 分别置于 (1) 室温条件下 (湿度:50%以下) ; (2) 40℃、75%RH条件下; (3) 25℃、92.5%RH条件下;在第0 d取 (1) 条件下样品3瓶;在第10 d取 (2) 、 (3) 2个条件下样品各3瓶、第30 d取 (1) 、 (2) 、 (3) 条件下样品各3瓶进行稳定性考察。每瓶在重复性条件下测定3次。

2.3 测定要求

能力验证研究对每个参加实验室随机安排一个唯y1性代码, 代码为001至166, 向每个参加实验室发送样品1瓶, 同时附有作业指导书、结果报告单和被测物品接受状态确认表等, 要求各参加实验室按照作业指导书进行测定, 并在规定期限内上报测试结果。测试结果以%为单位, 结果保留4位有效数字。

2.4 结果统计分析方法

依据CNAS制订的分析实验室能力验证的统一要求^[4], 能力验证采用稳健 (Robust) 统计技术处理实验室的检测结果。即采用稳健统计的中位值作为值, 标准化四分位距 (NIQR) 为变动性度量值 (目标标准偏差) 计算各实验室结果的Z比分数 (Z值) 。根据单一样品的结果计算实验室Z比分数。

按下式计算Z值:

式中:x-参加者测试结果;X-值;NIQR-标准化四分位距。

涉及的统计量有结果数、中位值及其不确定度、标准化四分位距 (NIQR) 、稳健的相对标准偏差 (RSD) 、小值、大值和极差等。

Z比分数评价实验室的结果, 即:若∣Z∣≤2, 检测结果为满意结果;若2<∣Z∣<3, 检测结果为有问题结果;若∣Z∣≥3, 检测结果为不满意结果或离群值。

3 结果与统计分析

3.1 测试样品均匀性检验结果

随机抽取本次能力验证样品10瓶, 按中国药典2010年版二部附录ⅧM, 法 (费休氏法) , A (容量滴定法) 测定水分。每瓶样品在重复性条件下测定3次。采用单因子方差分析法 (one way ANOVA) ^[5]对检验结果进行统计处理, 结果表明在置信度95%时样品的均匀性均满足要求。

临界值:F_{0.05 (9, 20)} =2.39, 统计量F小于此值。这表明在α=0.05显著性水平时, 样品是均匀的。

3.2 测试样品稳定性检验结果

取完整包装的样品各3瓶, 按“2.2”项下的试验条件进行样品水分的稳定性考察。采用t检验法^[5]评价样品在3个条件下第n d和第0 d (均匀性检验样品) 水分测定结果的一致性。结果表明, 两者间无显著性差异, 样品的稳定性满足要求。

查表得在显著性水平α=0.05, 自由度为37 (n₁+n₂-2) 时t_0.05, 37的临界值为2.026, 样品水分测定值的统计量t均小于该临界值。这表明在此显著水平时, 样品在3个条件下放置10 d、30 d与第0 d均匀性实验时的水分测定结果无显著性差异, 即经过加速稳定性考察的样品与均匀性检验的样品结果无显著性差异。

从发送样品到实验室收到样品并完成检验不超过30 d时间, 且这段时间中样品于常温条件下保存, 样品的稳定性能满足要求。

3.3 药品水分测定能力验证结果

提交检测结果的实验室共166家, 将所有水分测定结果绘制频率分布图。从图1可见, 样品的检测结果基本呈单峰分布, 峰形大致对称。基于这种数据分布, 依据规定^[6], 适合采用稳健统计方法评价各参加实验室的测试结果。

关于值的计算, FAPAS优先采用的是计算参加实验室的Huber Robust均数, 而国内普遍采用的是NATA和CNAS推荐的中位值法^[11]。其实, 当数据为单峰和大致对称时, 中位值或Huber Robust均数的数值是相近的。本次能力验证采用CNAS推荐的稳健统计中位值法^[4]。

图1 参加实验室检测结果频率分布图

稳健统计方法是一种不易受到异常值影响的统计方法。在通常采用的统计方法中, 计算一组数据的平均值 (mean) 容易受到异常值影响, 而在稳健统计方法中, 是以中位值 (median) 代替平均值, 以归一化IQR代替标准偏差。因此能准确反映出数据的统计特征。

提交结果的166家实验室参与了统计, 其中139家的结果为满意, 16家的结果有问题, 11家的结果为不满意。

能力验证的结果通常可使用Z比分数柱状图表示, 见图2, 该图不但能帮助组织者解释结果, 对于参加者也非常有用, 特别对那些带有离群值的参加者, 能够看到他们提交的结果与其他实验室结果的差异, 从而对实验室能力进行评估。

图2 实验室Z比分数柱状图

4 技术分析和建议

根据王君等^[12]发表的“费休氏水分测定法的不确定度评定”一文中的各个不确定度分量并结合本次能力验证各参加单位的结果报告, 共筛选出了以下几个方面阐述费休氏水分测定的技术难点。

4.1 费休氏试液的标定

费休氏试液的标定, 中国药典是选用纯化水精密称定后用费休氏试液滴定进行标定, 标定应取3份以上, 且3次连续标定的结果其相对标准偏差应在1%以内, 方能进行供试品水分的测定。

从结果来看, 共27家参加者的结果可疑或不满意, 其中有5家标定数据的相对标准偏差超过1%, 有的甚至高达3.74%, 说明标定过程没有达到稳定状态, 这样计算得出的F值是不准确的, 这可能是导致终结果偏差的直接原因;另有部分实验室未提供标定数据, 无法考证其标定的准确性, 这也反映部分实验室在日常的实验过程中没有很好地关注这个关键步骤。

文献报道^[12]水的重量引入的不确定度分量大, 占结果不确定度的66%以上, 且水的重量要求达到10 mg以上, 才能得到可靠结果。个别参加者在标定时称取纯化水的量低于10 mg, 而中国药典规定标定时取纯化水10~30 mg, 取样量减少也可能导致结果的不准确性增大, 导致了能力验证结果为不满意。

4.2 滴定度的影响

费休氏试液滴定度太低或太高对滴定的准确性也有一定的影响, 当滴定度较低时, 需要消耗大量的滴定液, 使滴定时间延长, 在滴定过程中也可能更多地引入空气中的水分, 从而影响结果的准确性;滴定度太高有可能使消耗的滴定液过少, 滴定体积的微量变化就可能影响结果, 造成偏差。本次各参加实验室费休氏试液的滴定度大多为3~5 mg·m L^-1, 但有个别实验室的滴定度较低, 消耗滴定液的体积大于5 m L, 若滴定管体积为5 m L, 则多次读数将引入误差, 已经产生错误操作, 其结果必然影响准确性。

4.3 称样量的因素

文献报道^[12]第三大不确定度分量是样品的称样量, 占结果不确定度的6.4%。作业指导书推荐供试品取样量为70~90 mg, 是考虑到应使消耗的费休氏试液在一定体积范围之间方能准确测定, 但是仍有个别实验室取样量过低, 有的甚至为20 mg, 过低的取样量直接导致消耗的费休氏试液量过低或与纯化水的标定所消耗的费休氏试液量相差太大, 从而引入的不确定度分量增大, 使结果不满意。

4.4 溶剂用量及溶解时间的影响

供试品在溶剂中是否*溶解直接影响到水分测定的结果, 作业指导书中明确告知各实验室“本品在甲醇中微溶”, 但有部分实验室没有关注其溶解性的问题, 在供试品取样量为70~90 mg的情况下, 无水甲醇的用量有20 m L、10 m L甚至5 m L的, 过低的溶剂量有可能造成供试品没有*溶解, 从而影响水分测定的结果。另有部分实验室没有提供无水甲醇的用量, 也说明实验室没有充分考虑到溶剂溶解性的问题。另外如果样品加入溶剂后直接测定, 溶解时间不充分的话也会影响检测的准确性和稳定性。部分结果不满意及可疑的实验室原始记录上也未能体现溶解时间, 这可能造成3份结果之间偏差过大或结果偏离的原因之一。

4.5 滴定仪器

有个别参加者采用较老式的玻璃水分测定仪 (手动滴定) , 这种仪器对人员的操作技术要求较高, 由于放置样品的容器与空气不*隔绝, 当环境湿度较大, 人员操作较慢, 人员对终点判断的准确性有欠缺, 以及由于系统不密闭情况下滴定液容易吸收空气中的水分等诸多因素都会影响结果的准确性, 终导致结果可疑或不满意。

另外, 水分的测定对卡氏水分仪器的密封性能要求很高, 新购的卡氏水分仪密封性能较好, 但随着使用时间的延长, 密封程度会有所变化:密封圈的老化, 干燥剂的失效, 长时间不使用导致仪器内部管路、滴定瓶、溶剂等吸附环境水分, 使测定过程出现终点延长, 重现性差, 结果偏大等一系列问题, 所以实验室应该注重仪器日常的维护保养及检定、校准、期间核查等工作, 在使用前也应及时更换干燥剂或在必要时更换密封圈等。