蛋白质纯化亲和层析法

药品试剂：
金属螯合亲和层析胶体 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL
◆ 在洋菜胶粒上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。
Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）
◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。
Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

方法步骤：
1） 亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，准备注入样本。
2） 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （IEX） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄亂胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 mL。
3） 待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打开出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。
4） 接着以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集各分划。
5） 所有分划均定量蛋白质并测定酶活性，收集酶活性高的数个分划，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。