科研实验中血标本提取RNA的方法

    在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。全血还不能直接放到-80℃保存，即使在-80℃保存，全血中的RNA也容易发生降解。传统的提取新鲜全血RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施，的RNA提取方法为RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA。

(一)淋巴细胞分离液分离单个核细胞：
    外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞
（1）外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。
（2）加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；
（3）加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。
（4）吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。离心1500rpm 20min。
（5）用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，zui后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70℃冻存，或直接提取RNA（可以*行细胞计数以保证细胞数）。

(二)红细胞裂解液分离单个核细胞：
（1）血液收集：用肝素抗凝，因为EDTA可能会对后续的pcr有影响，因为EDTA会螯合pcr反应中的Mg2+，也可以根据实验的具体要求看选择怎么样的抗凝。
（2）白细胞的分离：一般选择1.5ML新鲜的血液，或选取冷冻的5ML的血液（冷冻血液的保存：先液氮速冻，再置于-80°保存），或隔天的5ML的血液，就可以分离到比较多的白细胞了。可以选择溶红素或红细胞裂解液按一定的比例（1：3或1：5）分离白细胞，一般在3500转离心6分钟即可，效果不好的话，可以重新裂解一次。
（3）分离得到的白细胞，立刻用质量好的TRIZOL裂解白细胞，如果不能马上提取的话，可以置于-20或-80保存，过后抽提（选择一般的组织或细胞的RNA抽提ELISA试剂盒即可）。

(三) RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA
    液体样本RNA提取试剂RN01 TRIpure LS。可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。操作时间比普通方法节约至少三分之一。

（1）在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。
（2）血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。
（3）此裂解液保存在-20℃下可达2个月，-80℃可达半年，4℃可以1天。
（4）样品在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体*分解。
（5）每1ml TRIpure加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~3分钟。在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层*-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA在于水样层，水样层的容量大约为所加TRIpure 容量的60%。
（6）将水样层转移到新EP管中(如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留)，zui初均化时的每1ml TRIpure 对应0.5ml异丙醇，将混合的样品在-15 -30°C条件下孵育10分钟；
（7）在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟（RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底；
（8）移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次（每1ml的TRIpure 至少加1ml的75%乙醇），在2~8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟；
（9）简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5~10分钟，不能让RNA沉淀*干燥那样会极大地降低它的可溶性）。部分溶解的RNA样品其A260/280比值<1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5%SDS溶液来溶解RNA，RNA还能被甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在–70°C。