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内切酶的特性、酶解与琼脂糖凝胶电泳

时间:2015/6/4阅读:250
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     限制性核酸内切酶:是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰等一起称为工具酶。

     琼脂糖凝胶电泳:是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率,因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA*段。

     EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐,(Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光,易于检测。可以检测10ng DNA

     质粒pCMV-Myc-T10 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)EcoR1 Xho1 核酸内切酶(TakaraEcoR 1Xho 1酶解缓冲液(10×H buffer)琼脂糖TBETAE缓冲液(10×)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上样液(6×)0.25% 溴酚兰,40%(W/V)蔗糖水溶液或30%的甘油。电泳仪,电泳槽,紫外透射仪,凝胶成像仪,一次性塑料手套等.

     琼脂糖凝胶的制备:称取0.8g琼脂糖,置于三角瓶中,加入100ml TBETAE工作液,瓶口倒扣一个小烧杯等,将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。

     胶板的制备:取有机玻璃内槽,洗净、晾干;取纸胶条(宽约1cm),将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上,放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃内槽上,控制灌胶速度和量,使胶液缓慢地展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右,待凝固*后,轻轻拔出梳子,在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAETris-乙酸)或TBETris-硼酸)工作液的电泳槽中使用。

     加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品,换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部,本实验样品孔容量约1520μl1 kb DNA ladder(共10条带): 在*个上样孔或zui后一个上样孔内加入6μl 1 kb DNA ladder50ng/μl )。

     电泳(带上手套操作):

     1.加完样后的凝胶板即可通电进行电泳; 

     2.建议在80100V的电压下电泳;

     3.当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳;

     4.将凝胶放入溴化乙啶(EB〕工作液(0.5μg/ml左右)中染色约20min

     为了获得电泳分离DNA*段的zui大分辨率,电场强度不应高于5V/cm(两电极间的距离)。电泳温度视需要而定,对大分子的分离,以低温较好,也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时,由于胶太稀,在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。

     观察与拍照:在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右,肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时,应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩,避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时,可采用快速凝胶成象系统。

     对于未进行切的质粒来说,常会出现两条电泳带,一条是(松弛)螺旋状质粒DNA带,另一条是超螺旋状质粒DNA的带,以超螺旋状质粒DNA居多,移动速度也zui快。有时还会出现三条带,其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化,其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间,所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时,这条带会很弱,有时看不到。

     本实验所用质粒pCMV-Myc-T10EcoR1单酶切后应为5.7kb;用EcoR1Xho1双酶切后应产生两条DNA*段,一条是3.8kb,另一条是1.9kb



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