南京信帆生物技术有限公司
免费会员

南京信帆生物:单克隆抗体技术

时间:2016/5/13阅读:213
分享:

一、单克隆抗体的概念和原理

  免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇,各种抗原分子具有很多抗原决定簇,因此,免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限,且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外,要把这些不同的抗体分开也极困难。近年,单克隆抗体技术的出现,是免疫学领域的重大突破。 

  (1)单克隆抗体的基本概念 抗体主要由b淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系,含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙,即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆,并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体,称为单克隆抗体。

  (2)单克隆抗体技术的基本原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞,但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下:


单克隆抗体制备示意图

二、基本方法

  抗原提纯与动物免疫 
  对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加*福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。
  选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。
  免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得价抗体为zui终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。
  骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
  选择瘤细胞株的zui重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用zui多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的zui高生长刻度为9×105/ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮*的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml,次日一般即为对数生长期细胞。
  在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(feedercell)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
  在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml,提前一天或当天置板孔中培养。
  细胞融合
  细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG,消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等,常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第1min滴加4.5ml培养液;间隔2min滴加5ml培养液,尔后加培养液50ml。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。
  有限稀释法
  筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔),按Poisson法计算,应有36%的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0%~20%孔底时,吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的ELISA测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
  单克隆抗体的制备和冻存
  筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。zui普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为5×105/鼠,可根据腹水生长情况适当增减。

elisa试剂盒,进口elisa试剂盒,elisa kit,进口血清,进口试剂,明胶酶谱法检测试剂盒,大鼠elisa检测试剂盒,人elisa检测试剂盒-南京信帆生物技术有限公司

会员登录

×

请输入账号

请输入密码

=

请输验证码

收藏该商铺

X
该信息已收藏!
标签:
保存成功

(空格分隔,最多3个,单个标签最多10个字符)

常用:

提示

X
您的留言已提交成功!我们将在第一时间回复您~
在线留言