ELISA间接法

一、实验试剂

1、碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)

2、PBS

3、封闭液

4、洗涤液

5、抗体稀释缓冲液

二、实验步骤

1. 包被抗原

1) 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀释抗原到 PVC 酶标板上的*排孔，按要求往后进行系列稀释。

2) 酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。孵育时间需要优化。

3) 倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

2. 封闭

1) 用含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点，每孔加 200 μl。也可用其他封闭剂如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。

2) 封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。

3) PBS 洗板 2 次。

3. 加一抗和二抗进行孵育

1) 每孔加入 100 μl 稀释好的一抗。

2) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，孵育时间需要进行优化。通常 2 小时孵育即可获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时，可4 °C 孵育过夜获得较强信号。

3) PBS 洗板 4 次。

4) 加标记二抗，每孔 100 μl。稀释到浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。

5) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。

6) PBS 洗板 4 次。

4. 检测

1) 用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。

2) 显示出足够深的颜色后，加终止液每孔 100 μl（如有必要）。

3) 酶标仪读取吸光度值（光密度）。