摘要
制备液相色谱技术作为一种能获得高纯度化合物的分离技术，近年来发展很快。与常规分析液相色谱相比，制备液相色谱的目的不是为了了解混合物中各个化合物的组成，而是通过色谱方法对混合物中各组分进行分离并分别收集，此时需要考虑的是收集组分的纯度、回收率、操作时间、溶剂消耗等。制备液相色谱又分为高压制备液相色谱和中低压制备液相色谱，前者分离效率很高，所获得样品纯度和回收率都较高，但同时也存在上样量小、仪器复杂且昂贵等缺点；而后者因其固有的分离过程快速、上样量大、仪器简单成本低廉等优势，目前在药物合成、天然产物提取、精细化工等领域得到越来越广泛的应用。
对于广大小分子药物合成人员而言，他们的研究工作中常常遇到这样的一类样品，即样品具有很高的极性或亲脂性，对于这类样品的分离纯化，一般不宜采用正相分离模式，原因在于样品可能会与正相分离柱中的硅胶固定相产生很强的相互作用从而导致无法洗脱。而反相分离模式则可以很好的满足此类样品的分离纯化要求，因而反相分离纯化正在获得越来越广泛的应用。本文主要探索的是反相分离纯化方法的放大，反相分离方法的建立通常基于分析型HPLC的分离结果，通过对分离条件进行调整，然后将方法转移到4 g、12 g或者25 g反相快速分离柱（以下简称Flash柱）上进行小量样品的分离，进一步优化分离方法，zui后将优化的方法放大至更大规格的Flash柱，从而达到分离纯化大量样品的目的。
实验部分
本文基于常州三泰科技公司生产的SepaFlash®键合相系列Flash柱进行分离纯化方法放大的探索，该系列产品的填料的基质为球形硅胶，硅胶表面键合相为C18，硅胶粒径为20 - 45 μm,孔径为100 Å，下表为该系列产品的具体规格参数。本实验主要用到的产品规格为25 g、80 g及120 g。
表1. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱参数
（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）
1. 样品
我们采用一组标准品混合物对分离纯化方法放大实验参数进行了初步探索，称取组份A（0.1 g）、组份B（0.4 g）及组份C（7.5 g）溶于100 ml甲醇溶液中，充分混合均匀后待用，混合物样品的化学结构式如图1所示。
图1. 混合物样品各组分的化学结构式
2. 上样量与Flash柱的选择
分离纯化方法放大主要是对待纯化样品的上样量进行放大，更大的上样量需要在更大规格的Flash柱上才能实现，一般来说反相Flash柱的上样量是其填料量的0.5%-1%左右，对于某些易分离的样品，其上样量可以超过1%填料量这个限制，因此，在实际研究中还需要根据样品性质对上样量进行调整。
3. 实验参数及结果讨论
实验过程中所用到的Flash柱规格分别为25 g和80 g，首先利用25 g Flash柱对1.2 ml混合物样品进行了分离纯化，实验参数参见表2，所得分离图谱如图2所示。在上样量为96 mg的情况下，相当于25g Flash填料量的0.4%，此时的分离图谱显示混合物样品得到了基线分离，且从各组分的分离度来看0.4%的上样比例还有较大的提升空间。根据这一实验结果，我们仅对流速进行了调整，而洗脱梯度等条件保持不变，我们进一步地利用80 g Flash柱对4 ml混合物样品进行了分离纯化，所得分离图谱如图3所示。从图3可以看出，保持与之前25 g规格Flash柱小试时同样的上样比例，可以获得十分一致的分离图谱，提示我们该放大方法对于此类样品有着可以预期的分离效果。
表2. 标准品Flash分离纯化实验参数
图2. 标准品混合物在25 g Flash柱上的分离图谱
图3. 标准品混合物在80 g Flash柱上的分离图谱
因此，我们处理样品量比较大的分离纯化任务时，可以先选用一根小规格的Flash柱进行小量样品的分离纯化，优化分离方法；然后选择一根大规格的同系列Flash柱进行上样量放大后的分离纯化，设置好相应的流速，将优化的分离方法导入，无需再次摸索分离方法，即可实现大量样品的分离纯化，从而大大节约宝贵的时间，降低溶剂消耗，提高工作效率。
4. 方法验证
图4. 某合成反应zui后一步，右侧为目标产物
为了验证反相Flash柱分离方法放大的实际效果，我们选择了某合成反应的zui后一步产物作为样品，通过上样量的放大，检验放大方法的实际分离效果。待纯化样品为如图4所示的合成反应产物，从结构式可知其极性很高，必须采用反相柱才能对其进行分离纯化。此外，由于合成反应会生成不需要的副产物，因此需要将目标产物从副产物等杂质中分离纯化出来，且目标产物的纯度应大于95%。
取合成产物样品1.25 g，溶解于10.0 ml甲醇中，充分混匀后待用。Flash分离纯化实验参数参见表3，具体分离方法见下表，所得分离图谱如图5及图6所示。
表3. 合成产物Flash分离纯化实验参数
图5. 合成产物在25 g Flash柱上的分离图谱
图6. 合成产物在120 g Flash柱上的分离图谱
由图5及图6可知，在实际样品的分离纯化方法放大过程中，仅需设置好与不同规格Flash柱相适应的流速，无需对其他参数进行改动，即可获得良好的分离效果，且两个分离图谱中目标物及其他杂质的保留时间及峰形等色谱参数保持一致，从而表明了放大方法的重现性及可靠性。经HPLC分析，Flash分离纯化zui终获得目标产物的纯度>95%，可以满足对目标产物纯度的要求。
结论
在本应用案例中，合成产物的上样量从162 mg放大至1.0 g，放大倍数为6倍，对应的Flash柱规格从25 g扩大至120 g，在此条件下对样品的分离纯化获得了良好的分离度及重现性。这一结果表明：利用SepaFlash®反相Flash柱，配合SepaBeanTM machine，可以实现对高极性样品分离纯化方法的放大，且整个方法放大过程无需改变其他实验参数，简单便捷，为广大实验室科研人员在从事相关课题时提供了一种的解决方案。
关于SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列产品
常州三泰科技公司SepaFlash® Bond Series C18反相柱系列产品具有多种规格（参见表4）。
表4. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱参数
（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）
（本文作者为CBG应用技术研究中心：钱美圆，徐波。有任何疑问，都可以和我们一起探讨）
