新手做ELISA实验：大家来围观解答

本期新闻中心应客户要求，让我们一起来围观回答新手做试验遇到的问题回答：
以下由客户自诉：
1.选用的是ELISA双抗体夹心法测定尿液标本中人肾损害分子-1（Kim-1）水平。某一国产96孔ELISA试剂盒（本次试验只用了48孔，猜想应该不是试剂盒的原因，由于好几个师姐用的都是这家的试剂盒，成果还能够，能做出规范曲线，且复孔间差异并不大）。
2.一次加样时刻：阐明书上要求一次加样时刻控制在5分钟内，而我的一次加样时刻根本在10min以上。
试验前预备：
1.尿液样本的搜集与保存：-80℃冰箱保存尿液标本1年左右，1周前在冰中消融分装，3000转离心30min取上清液（因离心管与离心机不匹配，故将尿液从原离心管吸至相匹配的离心管中，原离心管下边有尿沉渣，吸的时分未打匀而是直接吸的，不知道是否对成果有影响？），需要用的放在4度冰箱（做试验用的标本也就是放在4度冰箱约1周的标本），暂时不需要用的放在-20度冰箱。
2.试剂盒从4度冰箱取出，将需要用的试剂及板拿出来放在试验台平衡45min。
3.尿液试验前未做稀释处理。
操作步骤：
1.规范品的稀释与加样：依照阐明书，我选用的笔直加样，只是加样速度慢，尽量加至底部，不触壁，不产生气泡。
2.温育阐明书上要求30min，而我的大概是35min，是在培养箱中进行的。
3.洗刷：也是加样速度慢，悉数加样后停了1min，甩干（甩到甩不出液体停止），然后在滤纸上拍干（拍到没有液体流出停止），就这样重复了5次。
4.显色：刚开始培养箱温度没升至37度，我也先放里边了，是等升至37度后开始计时的。
疑问：
1.为什么规范孔的浓度会呈现如上图的成果？
2.为什么复孔间的差异这么这么的大？
试验中没有少加或加错样，恳请各位战友帮助找原因，不胜感激！
1.为什么规范孔的浓度会呈现如上图的成果？  

你规范品也就120-80ng/L有些线性，可使后边的40-10ng/L OD值又再次俄然高上去了，且40-10ng/L的OD值复孔间偏差还算不大。我觉得你先从稀释的视点看看吧，阐明书供给的稀释办法太费事，可能会导致操作时呈现问题，你不如在洁净的EP管中依照规范品的比例关系进行稀释，稀释完后再一致参加酶标板孔中。
2.为什么复孔间的差异这么这么的大？ 我觉得两方面原因，你规范品复孔差异大，可能跟稀释方法有关。你的样本OD值3复孔间有时会呈现偏差较大的状况 可能跟洗板有关系，用洗板机洗板洗，可能与你尿样未混匀也有关（虽然可能性很小）。可是我觉得和你说的：“故将尿液从原离心管吸至相匹配的离心管中，原离心管下边有尿沉渣，吸的时分未打匀而是直接吸的”没有什么关系，究竟你已经离心取上清了。
至于加样时刻5min仍是10min，温预30min，仍是35min等等操作上与阐明书略有差异的当地都不是呈现你这种成果的直接原因，究竟双抗体夹心法的试剂盒对操作和时刻没有竞争法那么严厉。