学者对于重组人β-防御素的表达和纯化研究说明

elisa试剂盒人防御素(Human defensins)属于抗菌肽家族,是人体内源免疫系统的重要组成部分。

人防御素具有广泛的抗菌谱,而且致病微生物不易对它产生耐药性,因此有很好的药用前景。

本文建立在实验室关于人B防御素2的成果基础上,考察了人β防御素3(HBD3)和人β防御素4(HBD4)的表达条件,人β防御素4的分离和纯化以及重组人β防御素4的抑菌活性。

本文利用进行了密码子优化的人β防御素4表达菌种BL21(DE3)/pET32-smHBD4,考虑诱导温度、诱导剂量、诱导时机、表达时间等因素,进行摇瓶发酵条件优化。

获得优化培养条件:诱导温度为34℃,IPTG量为0.4 mM,诱导时机为对数生长期中期,诱导后表达6hour终止。通过条件优化,目标蛋白融合蛋白TrxA—HBD4产量可达2.68g/l左右(即成熟的HBD4可达0.69g/l),目标融合蛋白占可溶蛋白65%左右。

随后,文章对所得重组人β防御素4(HBD4)的分离纯化工艺进行了探索,在经过Ni离子亲和层析,肠激酶酶切,阳离子交换层析,凝胶脱盐和冷冻干燥一系列处理后,获得了纯度为95%的重组HBD4,整个分离工艺流程回收率为53%。

接着,本文对重组HBD4的抑菌活性进行了考察,通过固体平板扩散法观察到了重组HBD4对绿脓杆菌P.aeruginosa ATCC27853和大肠杆菌E.coli K12D31的抑菌活性;采用液体培养法,考察了重组HBD4浓度与其对大肠杆菌E.coli K12 D31的抑菌活性的关系,并绘制了杀菌曲线。

此外,论文还对人β防御素3的表达条件进行了优化,获得优化条件:诱导温度为34℃,IPTG量为0.4 mM,诱导时机为对数生长期中期,表达时间为8hour。

通过条件优化,目标蛋白融合蛋白TrxA—HBD3产量可达2.55g/l左右(即成熟的HBD3可达0.56g/l),目标融合蛋白占可溶蛋白66%左右。
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