酶免疫检测技术分析方法

酶免疫检测技术分析方法

1．标记抗原

(1)全酶标记抗原用于测定小分子化合物的酶有溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖一6一磷酸脱氢酶等，进口原装elisa试剂盒通过双功能交联剂N一羟基丁二酰亚胺酯与抗原共价结合。

(2)辅基标记抗原 预先将葡萄糖氧化酶在酸性条件下水解成葡萄糖氧化酶蛋白和黄素腺嘌呤双核甘酸(FAD)两种成分，它们单独存在时无酶活性，但可组成具有酶活性的葡萄糖氧化酶。试验中，先将FAD标记到抗原分子上，当此标记试剂与抗体结合后，FAD即失去重组能力。

(3)辅酶标记抗原这是利用偶联酶系统的反复增幅放大作用能检测微量辅酶的特性而建立的一种超敏感方法。

(4)底物标记抗原 大都选用口半乳糖苷酶的荧光性底物——4一甲基伞形酮基β-D半乳糖苷(4MUG)标记抗原。

2．标记抗体

(1)标记抗体酶抑制免疫测定法 常用磷脂酶c与IgG抗体分子经水溶性羟化和亚胺共价交联成酶标抗体，底物为SRBC(绵羊红血细胞)壁中的磷脂物质。将待测样品、酶标抗体和SRBC加在一起．当抗原抗体结合后可抑制标记抗体中的酶对SRBC壁中磷脂的水解能力，SRBC则不发生溶解。

(2)酶增强免疫测定法此法需两种抗体试剂。首先在待测样品中加入少量β-半乳糖苷酶标记的抗体．经抗体、抗原结合后，加入琥珀酰化的带过量负电荷的抗体，与抗原发生第二次结合，使其表面的负电荷大大增强。当加入带正电荷的小分子底物邻硝基半乳糖吡喃苷时．由于静电引力作用，在抗原分子周围形成大量的酶底物结合物，经比浊(355nm)测定，可确定抗原含量。

(3)配对酶双标记系统 配对酶亦称偶联酶，其中一种酶催化底物产生的物质正好是第二种酶的底物。

3．不均相酶免疫试验

不均相酶免疫试验是目前广泛应用的方法。酶结合物直接与样品中的抗原、半抗原或抗体进行免疫化学反应形成酶免疫复合物，它与游离的酶结合物在物质上或多或少是相同的．因此需将其分离后．进口原装elisa试剂盒再进行酶的活性测定．并计算样品中抗原、半抗原或抗体的含量。

(1)直接法将所选择的酶通过适当的交联剂．与特异抗体球蛋白，与相应抗原温育，然后用该酶的特殊底物，显示抗原一抗体复合物的存在。

(2)间接法抗原与相应抗体反应后．用酶标记的抗球蛋白温育，然后用该酶的特殊底物．显示抗原抗体复合物的存在。

(3)双重抗体法将抗原的溶液与含特异性抗体的免疫球蛋白致敏载体表面温育，洗去过剩的抗原溶液．然后加入酶标记的特异性抗体球蛋白，这种酶标记的抗体球蛋白吸附到已被致敏的载体表面所结合的抗体上。温育后，洗去过剩的酶标记抗体球蛋白。使用特殊的底物显示复合物的存在。 另外。进口原装elisa试剂盒还有专门检测抗原的标记抗原竞争法和不需要使酶与抗体或抗原交联的不标记抗体酶方法。