原代细胞培养的优化方法

原代细胞培养的优化方法

1)选用密度的健康细胞

细胞的汇合度应为40–80%，并且传代次数较低(比如小于50次)，即细胞不可太老。 随着时间的推移，相对于较早传代的细胞，培养原代细胞的表型和生长特性通常会呈多样变化，这也会体现在表达谱中。

在培养条件影响下(例如频繁的温度和pH值变化、过度培养时培养基中的营养不足、继代培养时细胞密度太低、胰蛋白酶连续处理、激烈吹打或离心时的剪切力以及支原体污染)，许多细胞的表达谱会发生改变。 每孔的细胞太少或太多，也会影响转染效率。 根据转染容器的表面积，尝试不同的细胞密度，比如设置低、中、高密度的孔。

2)选择恰当的培养基和培养条件

使用的组织培养操作方法。 siRNA递送过程中，抗生素不是必需的，细胞吸收抗生素后可能会增加毒性。此外，一些siRNA转染试剂要求在无血清或低血清的培养基中转染，所以一定要注意的建议。选择恰当的细胞培养基(例如某些细胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

3)选用高质量siRNA，使用Z低有效浓度

siRNA中应不含从合成过程带来的试剂(例如乙醇或盐)。 长于30bp的双链RNA污染物可通过激活非特异性的干扰素反应，产生细胞毒性，从而改变基因的表达。 Ambion公司标准纯度的siRNA没有此类污染物，非常适合细胞培养实验。原代细胞 在优化递送条件的实验中，确定选用的方法和细胞类型所需siRNA的Z低有效浓度，过量使用siRNA会增加非特异性(脱靶)效应。

4)使用siRNA阳性和阴性对照以及未处理的样品来监测每次实验的siRNA递送

每次实验必须包含siRNA阴性和阳性对照，以便监测siRNA的递送效率(即比较siRNA阳性对照处理的和siRNA阴性对照处理的细胞靶标基因的表达水平)。 在多数经验证的siRNA调控和细胞体系中，可看到mRNA调控靶标抑制效率高于≥70%。 此外，应通过比较siRNA阴性对照和未处理的样品中培养的细胞活性来监测siRNA递送过程的细胞毒性。

5)优化转染试剂选择和剂量

不同细胞系和细胞类型的转染难度差别很大。 RNAiMax转染试剂能够有效地将小RNA递送到各种细胞中，而且细胞毒性非常小。

对于难转染的细胞系(如悬浮细胞、血液细胞、原代细胞和神经细胞)，某公司的科学家们建议在不同的浓度下至少尝试2种不同的转染试剂。转染试剂剂量不足会影响siRNA递送和基因沉默效果，过多则会有细胞毒性。根据不同的细胞类型，需要不同数量的转染试剂。

如果转染结果不成功(基因抑制和/或细胞活性差)，可考虑采用电转化方法或病毒载体来递送siRNA。

6)优化转染试剂/siRNA复合物接触时间：siRNA Complexes

转染效率受转染试剂/siRNA复合物的剂量影响。如果细胞毒性和靶基因抑制效率都很高，转染8–24小时后，可利用正常培养基更换含有转染试剂/siRNA复合物的培养基，从而降低细胞毒性并保持高的基因沉默效应。

7)如有可能，监测mRNA和蛋白的抑制

测量mRNA抑制效果，是监测siRNA处理效果的Z直接的方法。通常在转染24 - 48小时后，对靶mRNA水平进行定量。 某些情况下，也需要测量蛋白的抑制效果，从而了解siRNA处理产生的生物效应——在siRNA递送48–72小时后测量。 蛋白表达减少问题受mRNA和蛋白质周转率的影响;原代细胞对于不同的靶标基因，观察蛋白Z大抑制效果的时间存在差异。