ATCC细胞转染实验步骤

1、ATCC细胞传代

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞*从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞*分散开。

(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积*培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

2、ATCC细胞转染

(1)转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡，。

(2)选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

(3)将混合液在室温放置10—15分钟。

(4)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

(5)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

(6)到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入*培养基继续培养24-48小时。

3、第二次ATCC细胞传代

(1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

(2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

(3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。