人正常组织来源细胞消化的要点

人正常组织来源细胞消化的一般程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如有不妥之处，欢迎指正，一起讨论：

1. 绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可。吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37℃消化。

2.什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成*分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是*成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可以尝试，准备的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者象有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现。

3.另一个帖子里提到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是*次听说，应该是网友自己发展出来的方法，很有参考价值。但我估计这个方法可能对付少数非常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我目前养过的近300株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Caco2其实是很好消化的细胞，不需要胰酶孵育即可，只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至*吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。

4.比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以coloncancer为例，比如HCT15,LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100mm dish，一次Z多加入500ul，就足够了，一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。

5，常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化（难消化细胞例外）即可。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求*。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对人正常组织来源细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

1 x 10^6 cells/vial 人小脑颗粒细胞 HCGC

1 x 10^6 cells/vial 人海马趾神经细胞 HN-h

1 x 10^6 cells/vial 人少突胶质前体细胞-贴壁生长 HOPC

5 x 10^6 cells/vial 人少突胶质前体细胞-悬浮生长 HOPC-os

1 x 10^6 cells/vial 人少突胶质细胞 HO

1 x 10^6 cells/vial 人星形胶质细胞 HA

5 x 10^6 cells/vial 人星形胶质细胞 HA

10 x 10^6 cells/vial 人星形胶质细胞 HA

5 x 10^5 cells/vial 人小脑星形胶质细胞 HA-c

5 x 10^5 cells/vial 人脊髓星形胶质细胞 HA-sp

5 x 10^5 cells/vial 人海马星形胶质细胞 HA-h
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