铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒优点:①灵敏度高、特异性强。
②时间短,2-3小时出结果。
③检测结果可定量。
④操作简便。
缺点:①对于已做支原体灭活处理的样品,由于支原体DNA仍旧存在其中,PCR结果会出现假阳性。(可用培养法做补充验证)
②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大(由于引物及内在设计不同),需谨慎选择,尽量在业人员推荐指导下使用。
组成及试剂配制:
1、酶标板:一块(96孔)
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静置大约10分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/L,然后做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
3、 样品稀释液:1×20ml。
4、 检测稀释液A:1×10ml。
5、 检测稀释液B:1×10ml。
【质量控制】
1.阴性对照:Ct 值>38 或未检出。
2.阳性对照:扩增曲线呈 S 型,且 Ct 值≤30。
3.同一实验以上要求需同时满足,否则本次实验视为无效。
4.每种检测靶标都需设阴阳对照,不同的靶标根据对应阴性调整基线阈值。
【结果判读】
1.FAM 通道检测 B 组链球菌。
2.阴性:Ct 值>38 或未检出。
3.阳性:扩增曲线呈 S 型,且 Ct 值≤35。
4.可疑:扩增曲线呈 S 型,且 35<Ct 值≤38,需复检;复检结果若一致,判定结果为阳性。
【检验方法的局限性】
1.样品采集、运输、保存不当,试剂运输、保存、配置不当都可能会影响实验结果,甚至会导致假阴性结果。
2.如果实验室污染、试剂污染、样品交叉污染,可能出现假阳性结果。
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