m6A MeRIP-seq联合Ribo-seq的研究思路

文章题目：METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis

发表期刊：Nature Cell Biology (5年影响因子：24.2)

研究单位：Beckman Research Institute of City of Hope，The University of Chicago，City of Hope Comprehensive Cancer Center等。

主要内容：METTL16作为一种最近被鉴定的RNA甲基转移酶，可以对一些转录本进行m6A修饰。METTL16能否对转录本进行RNA甲基化修饰目前尚不清楚。该研究揭示了METTL16在基因调节中表现出甲基转移酶活性依赖和非依赖的双重作用。在细胞核中，充当m6A的writer将m6A“写入"到数百个特定mRNA靶标中。在细胞质中，METTL16以一种m6A非依赖性方式促进翻译。METTL16通过Mtase结构域与真核翻译起始因子eIF3a/b和rRNA相互结合，促使翻译起始复合体的组装，并促进超过4000条mRNA转录本的翻译。此外，METTL16对肝细胞癌的肿瘤发生至关重要。总之，该研究揭示了METTL16在肝癌中通过RNA甲基化和翻译调控的双重功能促进肿瘤发生。

研究意义：该研究揭示了METTL16不仅通过m6A修饰调控基因表达，还通过与eIF3a/b和rRNA相互作用促进翻译起始，从而推动肿瘤生长。靶向METTL16/eIF3a/eIF3b轴可能代表癌症治疗的新策略，未来开发针对METTL16 Mtase结构域的有效抑制剂，可能为癌症治疗提供新的方向。

研究结果：

1. METTL16的m6A修饰功能

METTL16是METTL家族成员之一，主要分布在细胞质中，少量分布于细胞核，这与主要位于细胞核的METTL3/14不同。研究发现，METTL16可以对mRNA转录本进行m6A修饰，但其全局m6A修饰程度低于METTL3/14。通过m6A MeRIP-seq和QQQ-MS分析，发现METTL16缺失导致3075个转录本的m6A丰度显著降低，其中334个是METTL16特异性靶标，主要参与细胞周期、凋亡、RNA结合和转录调节等过程。此外，METTL16在新转录RNA的m6A修饰中起重要作用，尤其是在外显子中。

图1. METTL3，METTL14和METTL16的亚细胞分布和对m6A的的催化活性比较分析。

2. METTL16促进全局翻译效率

METTL16不仅参与m6A修饰，还显著提高翻译效率。实验表明，METTL16显著提高荧光素酶的翻译效率，甚至超过METTL3。METTL16缺失明显减弱蛋白质合成，且这种抑制不能通过METTL3/14的高表达恢复。METTL16定位于5'cap区域，参与翻译起始过程，表明其在翻译调控中的重要作用。Ribo-seq鉴定了METTL16 KO介导的翻译抑制事件，这些差异TE转录本主要在RNA结合、RNA加工、细胞周期和mRNA代谢过程等途径中富集。

图2. METTL16提高了靶RNA的翻译效率。

3. METTL16与eIF3a/b结合促进翻译启动

METTL16通过与翻译起始因子eIF3a/b直接结合，促进翻译起始。Co-IP实验证实METTL16与eIF3a/b直接互作，且这种相互作用不受RNA影响。原位邻位连接分析（PLA）进一步验证了METTL16与eIF3a/b在细胞质中的物理相互作用。Polysome profiling分析发现METTL16和eIF3a/b在40/60/80S核糖体中富集，表明其参与翻译起始过程。METTL16介导的翻译起始与其甲基转移酶活性无关。

图3. METTL16通过与eIF3a和eIF3b直接结合，促进翻译启动。

4. METTL16的Mtase结构域在翻译调控中的作用

METTL16的Mtase结构域（79-289aa）直接与eIF3a/b结合，对METTL16介导的翻译效率至关重要。通过截短突变体实验，发现Mtase结构域对于METTL16与eIF3a/b和5'cap的结合是不可少的。此外，METTL16在胞质中发挥主要生物学作用，NLS突变体能够恢复翻译抑制和生长抑制。

图4. 翻译调控既需要MTTL16的Mtase结构域，也需其胞质定位。

5. METTL16与rRNA相互作用促进80S TIC的形成

METTL16通过与18S rRNA（40S核糖体亚基）和28S/5.8S rRNA（60S核糖体亚基）相互作用，促进80S翻译起始复合物（TIC）的形成。METTL16促进eIF3复合物与40S核糖体亚基的相互作用，进而促进43S前起始复合物（PIC）的组装和80S TIC的形成。核糖体图谱分析显示，METTL16缺失显著减少了80S核糖体的形成。

图5. METTL16与eIF3a/b和rRNA相互作用，促进80S TIC的形成。

6. METTL16在肝细胞癌（HCC）中起促瘤作用

METTL16在肝癌患者中表达显著升高，且与预后差相关。METTL16缺失显著抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵入。通过回补实验，发现野生型METTL16恢复METTL16 KO诱导的生长抑制，而催化失活突变体只能部分恢复。METTL16的Mtase结构域对HCC细胞的生存至关重要，且其致癌作用需要Mtase结构域。异种移植小鼠模型显示，METTL16缺失在体内显著抑制HCC肿瘤的形成和进展。

图6. 在肝癌中METTL16起重要的促进作用。

m6A MeRIP-seq联合Ribo-seq的研究思路

1. 研究背景

m6A（N6-甲基腺苷）是常见的RNA修饰，影响mRNA的稳定性、翻译和降解。m6A MeRIP-seq（甲基化RNA免疫共沉淀测序）用于全基因组水平检测m6A修饰，而ribo-seq（核糖体图谱测序）则用于研究翻译过程。联合这两种技术可以揭示m6A修饰对翻译的调控机制。

2. 研究目标

1)     确定m6A修饰在转录组中的分布。

2)     分析m6A修饰对翻译效率的影响。

3)     探索m6A修饰在特定生物过程中的作用。

3. 实验设计

3.1 样本准备

1)     选择合适的细胞系或组织样本。

2)     分为实验组和对照组，如敲除m6A甲基转移酶或去甲基化酶的细胞。

3.2 m6A MeRIP-seq

1)     RNA提取与片段化。

2)     使用m6A特异性抗体进行免疫沉淀。

3)     建库测序，识别m6A修饰位点。

3.3 Ribo-seq

1)     提取核糖体保护的RNA片段。

2)     建库测序，分析翻译效率（TE）。

3.4 数据分析

1)     m6A MeRIP-seq数据分析：识别m6A峰，定位修饰位点。

2)     ribo-seq数据分析：计算翻译效率，识别翻译活跃区域。

3)     联合分析：整合m6A MeRIP-seq和Ribo-seq数据，识别受m6A调控的翻译事件。比较m6A修饰与翻译效率的关系，识别受m6A调控的基因。

4)     功能富集分析：GO和KEGG分析受m6A调控的基因功能。

5)     网络分析：构建m6A修饰与翻译调控的分子网络。

4. 验证实验

1)     qPCR验证m6A修饰和翻译效率的变化。

2)     Western blot验证目标蛋白表达水平。

3)     CRISPR/Cas9编辑m6A修饰位点，验证功能。

5. 预期结果

1)     绘制全基因组m6A修饰图谱。

2)     了解受m6A调控的翻译事件列表。

3)     揭示m6A在特定生物过程中的调控机制。

6. 研究意义

1)     深化对m6A修饰功能的理解。

2)     全面解析m6A修饰对翻译的调控机制。

3)     为疾病治疗提供新靶点。