DAP-seq技术助力揭示拟南芥根基本组织发育的调控机制

2024 年 11月 18 日，兰州大学黎家教授团队在《Current Biology》（IF=8.1）发表了题为“Three RLKs integrate SHR-SCR and gibberellins to regulate root ground tissue patterning in Arabidopsis thaliana"的研究论文，该研究揭示了受体激酶ARH1、FEI1和FEI2共同调控根基本组织发育的分子机制，并借助DAP-seq技术发现SHR和SCR可能通过与其他调节蛋白的相互作用来抑制这些RLK的表达。

研究背景

在拟南芥中，根部早期发育阶段的基质（GT）由皮层和内皮层组成。在基质成熟过程中，内皮层偶尔会发生额外的周缘细胞分裂（PCDs），在皮层和内皮层之间形成中间皮层（MC）。已鉴定出多种调节蛋白和植物激素参与基质模式的形成，如SHORT ROOT（SHR）、SCARECROW（SCR）、CYCLIND6；1（CYCD6；1）和赤霉素（GAs）。受体样激酶（RLKs）家族（如LRR-RLKs）在根发育中的作用也逐渐被关注，但这些因素之间的相互关系尚未阐明。

技术路线

研究结果

本研究通过遗传筛选寻找影响皮层组织模式的突变体，并结合分子生物学、细胞生物学和生化方法验证候选基因功能，发现ARH1、FEI1和FEI2在调控拟南芥根尖的GT模式中起着关键作用。

图1 ARH1、FEI1和FEI2的三重突变体在根尖内皮组织中表现出增强的PCD。

图2 三重突变体根尖的附加细胞层表现出MC的细胞特征。

图3 ARH1、FEI1和FEI2主要以细胞自主的方式调节MC的形成。

研究显示ARH1、FEI1和FEI2的转录水平受到SHR和SCR的负调控。作者通过BiFC检测发现SHR和SCR并不是通过蛋白质-蛋白质相互作用直接调节RLKs的功能。随后为进一步研究了这些RLKs的转录水平是否受SHR和SCR的直接调控，作者使用了Chip-seq和DAP-seq技术检测这些转录因子和DNA序列之间的相互作用，结果发现这些RLKs的启动子和两种转录因子之间不存在相互作用。同时采用酵母单杂交系统和荧光素酶(LUC)报告基因系统进行了验证，也未能检测到三个RLKs的启动子和两个转录因子。这些结果表明，SHR和SCR可能通过一种间接的机制负调控三个RLKs的转录水平。

图4 SHR和SCR负调控ARH1、FEI1和FEI2的转录水平。

图S5 使用四种不同的方法检测SHR/SCR与ARH1、FEI1和FEI2启动子之间的潜在相互作用。

为了进一步理解ARH1、FEI1和FEI2调节GT模式的机制，作者通过外源GA和PAC（GA生物合成抑制剂）处理结合突变体分析，结果表明RLKs通过调节GAs的合成来影响根基本组织发育。同时通过共聚焦和RT-qPCR分析根尖CYCD6;1基因的表达变化，明确了CYCD6;1在根基本组织发育中的作用。以上结果，提出并证明了SHR/SCR-ARH1/FEI1/FEI2-GAs-CYCD6;1的根基本组织发育调控模块。即在根发育早期，受体激酶通过调节GAs的合成抑制CYCD6;1在根尖内皮层中的异位表达，进而抑制中皮层形成，精确调控根基本组织的发育。

图5 ARH1、FEI1和FEI2通过根尖GA的生物合成调节GT模式。

图6 SHR和SCR突变体根尖中催化GA生物合成酶编码基因的转录水平升高。

图S6 抑制GA生物合成可部分挽救shr和scr中MC形成减少的表型。

综上所述，该研究明确了ARH1、FEI1和FEI2三个受体激酶在整合SHR-SCR信号通路和GA信号来调控根基本组织模式中的关键作用，揭示了根基本组织发育的分子调控机制。