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革兰氏染色的实验原理与方法步骤!

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产地 国产 加工定制
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详细介绍

            革兰氏染色的实验原理与方法步骤!



革兰氏染色的实验原理与方法步骤!


革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法:这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative)。这一染色方法由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明,初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系,后推广为鉴别细菌种类的重要特性之一,对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗有着广泛用途。


⒈步骤

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是:

1)涂片固定。

2)草酸铵结晶紫染1分钟。

3)蒸馏水冲洗。

4)加碘液覆盖涂面染约1分钟。

5)水洗,用吸水纸吸去水分。

6)加95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱色,20秒后水洗,吸去水分。

7)蕃红染色液(稀)染1分钟后,蒸馏水冲洗。干燥,镜检


⒉原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。

染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。

①革兰氏阳性细菌的细胞壁

G+细菌细胞壁具有较厚(20-80nm)而致密的肽聚糖层,多达50层,占细胞壁成分的40%~95%,它同细胞膜的外层紧密相连(图2-9)。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也称胞壁质(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷,它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素(autolysins)酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶。

如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜。除链球菌外,大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。

②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15~20nm)而结构较复杂,分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2~3nm)(图2-10)。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space)。

外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。

LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脱氧已糖。由于糖的种类不同,使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。

外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞;有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体;许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins)。

肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。

壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12~15nm,呈胶胨态。其间含有三类蛋白质:水解酶,催化食物的初步降解;结合蛋白,启动物质转运过程;化学受体(chemoreceptors),在趋化性中起作用的蛋白。

⒊染色结果

革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。


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