上海蚁霖科学仪器有限公司
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阅读:161发布时间:2021-11-8
1 材料
1.1 细胞
大鼠心肌细胞株 H9c2(购买于中国医学科学院协和医学院基础医学细胞中心)。
1.2 药品与试剂
附子样品共 4 批,购自四川江油中坝附子科技发展有限公司,产地分别为云南(批号:HSPYN)、陕西汉中(批号:HSPSXHZ)、四川江油(批号:HSPSCJY 和 HSPSCJY1)。新(中国食品药品检定研究院,批号:110799-201608);DMEM 培养基(美国 HyClone 公司,批号:AE);胎牛血清(美国 Gibco 公司,批号 A10112-2770);0.25 % 胰 蛋白酶(美国HyClone 公司,批号:MHE86395);青、*(美国 Hyclone 公 司,批 号:AB,J170012);CCK-8(碧云天生物 技 术有限责任公司,批号:);PBS(北京益美源生物科技有限责任公司,)。
1.3 仪器
MCO-15A 型 CO2 培养箱(日本三洋电机国际贸易有限公司);YUETAN 型超净工作台(北京半导体设备一厂);DT5-6A 型台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);Axioobserver 倒置显微镜(德国 ZEISS 公司);Multiskan FC 型酶标仪(美国Thermo 公司);ME104E 型电子分析天平(瑞士梅特勒 - 托利多公司);其林贝尔QL-901 型涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);96 孔细胞培养板及培养瓶(美国 Corning 公司)
2 方法
附子水提物由中国中药有限公司制备,制备方法如下:分别称取黑顺片 200 g,浸泡 30 min,煎煮2 次,第 1 次加 9 倍量水,煎煮 30 min,第 2 次加 7倍量水,煎煮 25 min,200 目筛过滤,65℃减压浓缩,测定浓缩液密度及干膏得率,冷冻干燥制备成冻干粉备用。4 个批次(批号:HSPYN、HSPSXHZ、HSPSCJY、HSPSCJY1)的附子水提物的干膏得率分别为 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物:精密称取各批号附子水提物冻干粉,加入 DMEM *培养基溶解。使用 0.22μm滤膜过滤杂质,配制为 0.25 mg·mL-1 附子水提物母液,再用 DMEM *培养基稀释至相应工作浓度,现用现配。新:精密称取新粉末,加入去离子水溶解,使用 0.22μm 滤膜过滤杂质,配制为 18 mg·mL-1 母液。冻存于 -20℃,使用时加入 DMEM *培养基稀释至相应工作浓度,现用现配。H9c2 细胞培养于 DMEM 培养基(含 10 % 胎牛血清,100 U·mL-1 青、*,4 mM L- *)中,置于 37℃,5%CO2 及饱和湿度的培养箱中培养。加入 1 mL 0.25% *按照 1:3 比例传代培养。取对数生长期细胞进行后续实验。
3 结果
结果显示,各密度下 H9c2 细胞在 0 ~ 48 h 为增殖期,48 ~ 60 h 到达平台期,60 ~72 h 进入衰亡期。当细胞密度为 2×105/mL 时,细胞生长过快,不利于下一步实验。故选用 0.5×10/mL 或1×105/mL 密度进行下一步实验。预实验结果显示附子水提物溶解浓度为250 μg·mL-1,因而选择给药浓度 125 μg·mL-1作为药物测试浓度;新作为阳性对照药,浓度选择为 100 μg·mL-1。结果显 示,当细胞密度为 0.5×105/mL,作用时间为 12 h 时,附子水提物和新对细胞增殖抑制作用较强,且作用稳定,RSD<15%。故选用 0.5×105/mL,药物作用 12 h 进行后续实验。
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