药物引发的肝毒性问题是终止新药研发和导致药物退市最主要的因素之一，同时也是政府监管行为见的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等均因严重肝毒性而被迫撤回。药物引起肝损伤的发病机制主要有药物直接损害、间接损害( 包括细胞毒性和胆汁淤积性) 、免疫介导性肝损伤、炎症反应、线粒体失能以及机体对药物的特异质反应。在相关发病机制中，我们对胆汁淤积性肝毒性知之甚少，其临床前预测也于评估药物抑制胆盐输出泵的能力，缺乏完善的评价标准。
1 药品与试剂
ASP，APAP，Nef，Tol，FA( 美国 Cayman 公司) ;Tro( 美国 ＲD 公司) ; Iso( 美国 Enzo 公司) ; *、*、胎牛血清、Willams'Medium E 培养基( Gibco公司) ; 引物合成( Invitrogen 公司) ; TＲNzol 总 ＲNA提取试剂、DL2，000 DNA Marker ［TaKaＲa( 宝生物)公司］; 抗体( Abcam 公司) 。
2 仪器
ＲT-PCＲ 试剂盒、cDNA 反转录试剂盒( Qiagen公司) ; 96 孔板( 美国 Corning 公司) ; CO2 培养箱( 美国 ThemoForma 公司) ; CCK8 试剂盒( 日本同仁化学研究所) ; *( Abcom 公司) ; QL-902 涡旋振荡仪( 海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ; Centrifuge 5415D 离 心 机 ( Eppendorf 公 司) ;NANODＲOP 2000 分光光度计( Therno Scientific 公司) ; Tanon 1600 凝胶成像系统( 上海天能科技有限公司) ; ABI7500 荧光定量 PCＲ 仪( Applied Biosystems 公 司) ; ELX 800 酶标 仪 ( 美 国 Bio-Tek 公司) ; HＲ220 掌上离心机( Servicebio 公司) ; Nikon Eclipse E100 正置荧光显微镜( 日本尼康公司) 。
3 细胞
HepG2 细胞( 本实验室冻存) ; HepaＲG 细胞( 美国 Millipore 公司) 。4 2D 及 3D 细胞培养HepaＲG 和 HepG2 细胞接种于含 10% 胎牛血清，100 μmL － 1*、100 μg·mL － 1*、4 mmol·L － 1 L-*的 Williams'Medium E 培养基中，于5% CO2 的 37 ℃ 恒温培养箱中培养，达到 70% ～80% 融合时，吸弃培养基，PBS 清洗，加*镜下观察细胞回缩变圆时终止消化，加少量培养基轻轻吹打制备细胞悬液，并传代。3D 培养条件下，将 HepaＲG 分别以每孔 100，200，400，800，1 600 个接种于U 型底低吸附 96 孔板中，于 37 ℃，5% 的 CO2 培养箱中培养，形成3D 微球结构，可持续培养28 d，其间通过镜下观察球体变化并记录其直径大小。
通过优化实验条件成功构建了 3D HepaＲG 肝毒性评价模型，能够从一定程度上反映出该体外模型的优势，也可以为胆汁淤积性肝损伤的研究提供一定的借鉴，但论据尚不充分，在接下来的研究中，将利用高内涵筛选技术检测化合物对细胞活力、代谢凋亡及信号转导等各个环节的影响，进一步探明引起药物肝损伤的毒性机制，从而为化合物的安全性预测提供实验依据。
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