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用其林贝尔脱色摇床对糖尿病小鼠氧化应激

阅读：145发布时间：2021-11-8

糖尿病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病致死率的微血管并发症，也是导致终末期的主要原因。DN 的主要病理特征为肾小球基底膜增厚、细胞外基质和系膜扩张、肾小球硬化伴有不同程度的肾间质和肾小管损害。DN 的发病机制包括肾素-血管紧张素-醛固酮（RAAS）激活导致的血流动力学异常和血流变因素、糖代谢紊乱、糖基化终产物、各种生长因子及细胞因子、氧化应激反应、遗传因素等。其中，高血糖导致的氧化应激起了关键作用。有研究表明，核因子红细胞衍生 2 相关因子/血红素氧合酶（Nrf2/HO-1）是细胞内抗氧化应激最重要的通路之一。

1 材料

1.1 实验动物

自发型 2 型糖尿病 C57BLKS/Jdb/db 小鼠（db/db）10 只，雄性，9 周龄，体质量（35.10±1.41）g（33～37 g），同遗传背景的 C57BLKS/Jdb/+小鼠（db/m）10 只，雄性，9 周龄，体质量（19.84±1.18）g（18～22 g），购自南京大学模式动物研究所，许可证号 SCXK（苏）2018-0008。本研究已通过南开大学动物护理与使用委员会批准。

1.2 药物与试剂

五味子（天津市中药饮片厂有限公司，批号1806038-01），经天津市医药科学研究所贾淑杰主任技师鉴定为木兰科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果实；小鼠尿微量白蛋白ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）检测试剂盒（北京碧云天生物科技有限公司）；过碘酸雪夫（PAS）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；反转录试剂盒、PCR 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；PCR 引物（北京六合华大基因科技有限公司）；兔抗 Nrf2 多克隆抗体、兔抗 HO-1 多克隆抗体、兔抗 β-actin 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；自行配制 TBST 缓冲液、5%牛奶封闭液、1×RIPA 蛋白裂解液、5×SDS、1×Running、1×Transfer。

1.3 主要仪器

、*（罗氏血糖健康医护公司）；台式高速低温离心机、酶标仪（美国 Thermo FisherScientific 公司）；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；超微量分光光度计（上海析谱仪器有限公司）；PCR 仪、琼脂糖凝胶电泳及成像系统、SDS-PAGE 电泳仪与转膜系统（美国 Bio-Rad 公司）；电热恒温金属浴（杭州奥盛仪器有限公司）；恒温水浴锅（天津化工有限公司）；脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；石蜡切片机（德国 Leica 公司）；CX31 正置显微镜（日本 Olympus 公司）。

2 方法

2.1 动物分组

10 只 C57BLKS/Jdb/db 小鼠和 10 只 db/m 小鼠在温度（22±2）℃，相对湿度（60±10）%，保持12 h 光照/12 h 黑暗交替的动物房中进行饲养，并保证相同自由饮水和常规饲料喂养，每 2 天更换 1 次垫料。顺应性喂养 1 周后，称体质量并测血糖，C57BLKS/Jdb/+小鼠随机分为对照组和 SE 对照组，C57BLKS/Jdb/db 小鼠随机分为模型组和 SE 治疗组，每组 5 只。

2.2 药物制备

按照 Zhang 等的方法和步骤，用乙醇循环萃取法制备 SE，五味子 100 g 用 95%乙醇每次加热回流 3 h，共提取 2 次，合并 2 次提取液，静置滤过，减压回收乙醇浓缩成浸膏，4 ℃保存，实验时稀释最终得到含生药 1 mg/mL 的 SE（经高效液相色谱分析，SE 中五味子甲素和五味子乙素的质量分数分别为 1.38%和 1.46%）。

2.3 给药方法

小鼠 10 周龄时开始 ig 给药，SE 对照组与 SE治疗组给予5 mg/kg的SE（给药前将SE放至室温，混匀后备用），对照组与模型组 ig 等量双蒸水，每天 1 次，连续给药 6 周。

3 结果

3.1 各组小鼠体质量、血糖、24 h 尿微量白蛋白测

定结果结果如图 1 所示，在实验 0 周时，与对照组相比，模型组小鼠体质量、血糖和 24 h 尿微量白蛋白均显著增高（P＜0.01）；SE 对照组与对照组比较，体质量、血糖和24 h尿微量白蛋白水平差异不显著；在 3、6 周时，SE 治疗组的血糖和 24 h 尿微量白蛋白水平明显低于模型组（P＜0.05、0.01），但 SE 治疗组与模型组比较，小鼠体质量无明显变化；对照组与 SE 对照组小鼠体质量亦无明显差异。