上海蚁霖科学仪器有限公司
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阅读：148发布时间：2021-11-8
动脉硬化闭塞症（arteriosclerosis obliterans，ASO）是周围血 管难治性疾病，其发病机制与脂质渗入、内膜损伤、血栓形成 和平滑肌细胞增殖有关，其中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖是ASO发病的关键环节。
材料
1. 动物及饲料
选用SPF级雄性日本纯种大耳白兔，体质 量约2~2.5kg，由北京昌扬西山养殖场提供，动物合格证号： SCXK（京）2011-0010，适应性喂养1周后用于实验。动物饲养 室温控制在20~25℃，相对湿度控制在50%~70%，通风良好。 饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。
2. 药物
当归*提取液制备：当归*由当归9g， 桂枝9g，芍药9g，细辛3g，甘草6g，通草6g，大枣5枚组成，各药 均购于山西中医药大学附属医院，取上述诸药经水煎、醇沉后 制成提取液, 每毫升含中药生药为0.58g，由山西中医药大学附 属医院药剂科提供。
3. 试剂
DMEM培养基、胎牛血清、*（美国GIBCO 公司）；二乙烯四乙酸二钠（EDTA）（美国SIGMA公司）；血管 紧张素Ⅱ（AngⅡ）（A9525，Sigma）；PVDF膜（*H00010， Millipore）；ERK1（ab9363，Abcam）；c-myc（ab11917，Abcam）； GAPDH（ab8245，Abcam）；HRP标记羊抗兔二抗（D110058， BBI）HRP标记驴抗鼠二抗（D110 085，BBI）；ECL底物液 （NCI5079，Thermo）；X光胶片（XBT-1，柯达）。
4. 仪器设备
倒 置 荧 光 相 差 显 微 镜（I X 7 2 型，日本 OLY M PUS）；CO2培养箱（QP-8 0型，博 科）；超净工作台 （JB-CJ-1500FX，浙江孚夏医疗科技有限公司）；低温离心 机（5810R型，德国EPPENDORF Centrifuge）；电热恒温水箱 （HHW21.600，苏州伟罗自动化烘箱科技有限公司）；电转仪 （Bio-Rad）；水平摇床（TS-1，江苏海门其林贝尔仪器制造有限 公司）；PH计（LP115，德国Metter-Toledo GmbH公司）；电子天平 （CPA，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。
方法
1. 药物血清的制备
①随机将雄性日本纯种大耳白兔，分 为正常组，当归*高、中、低剂量组，每组各5只。
②灌胃给 药，按“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算，用 药组低、中、高剂量以1、2、4倍于临床等效剂量给药，分别灌 胃当归*提取液0.95、1.9、3.8mL·kg-1·d-1（3组均用0.9% 氯化钠溶液定容为10mL），正常组每日灌胃0.9%氯化钠溶液 10mL，1次/d，共喂养2周。
③兔耳中动脉采血，分离血清，56℃ 灭活30min，分装后放置-20℃保存备用。
2. 兔血管平滑肌细胞培养
采用组织贴块法：
①将动物 处死，在无菌操作下，取出兔胸主动脉；
②将动脉放入培养皿 中，剥离外膜结缔组织，冲洗血管内残血，纵行剖开血管，轻轻 刮去内膜，用DMEM培养液冲洗；
③用撕下中膜平滑肌， 剪成约1mm3 左右的组织块，再用DMEM培养液冲洗3次；
④用吸 管将组织块送入培养瓶内，将组织块按每块间距0.5cm左右密 度均匀摆在瓶底；
⑤翻转培养瓶使瓶底朝上，瓶内加入DMEM 培养液（含20%胎牛血清），倾斜放置在37℃、5%CO2培养箱内 3～4h；
⑥待组织块边缘干固后，将培养瓶翻转，使组织块*浸泡在培养液中，静置于37℃、5%CO2培养箱内4d；
⑦每4～5 天换1次培养液，待细胞长成致密单层时，以含0.1%* 和0.1%EDTA的消化液消化传代，传代后用含10%胎牛血清的 DMEM培养。第3～5代细胞用于实验。
3. 细胞培养及处理
将生长良好的细胞用0.1%* 和0.1%EDTA的消化液消化，用含10%胎牛血清DMEM配成单 个细胞悬液；以5×103 /孔的密度，接种于96孔板中，放置37℃、 5%CO2培养箱中培养；24h后，每组更换为含有5%正常组血清 的培养基；加入不同浓度的当归*和同浓度血管紧张素 AngⅡ（1×10-8mol/L），并分为5组：正常组（正常兔血清）、模型 组（正常兔血清+AngⅡ）、高剂量组（当归*高剂量血清+ AngⅡ）、中剂量组（当归*中剂量血清+AngⅡ）、低剂量组 （当归*低剂量血清+AngⅡ）；放置37℃、5%CO2培养箱中 培养72h；处理结束后收样，保存于-80℃冰箱备用。
4. Western Blot法检测
兔血管平滑肌细胞中ERK1、c-myc蛋 白的表达 电泳：各样品取10μL总蛋白上样电泳，根据蛋白分 子量配制15%的PAGE胶电泳。根据预染marker显示，判断目的 蛋白得到充分分离后，停止电泳。 转膜（湿转法）：取出凝胶用蒸馏水冲洗，PVDF膜用甲醇 浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤 维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好， 夹紧板后放入转膜仪内。转膜条件：ERK1，c-myc---100V， 60min。封闭：用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF 膜，室温摇床封闭1h。一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使 PVDF膜浸泡于一抗孵育6次，5min/次。二抗：使PVDF膜浸泡 于二抗孵育液中，室温摇床孵育1h。显色曝光：TBST充分洗涤 PVDF膜5~6次，5min/次。每张膜滴加适量的ECL底物液，孵育 数分钟。X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。
5. 统计学方法
应用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间资 料应用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 见图1-图4。结果显示：与正常组比较，模型组ERK1、c-myc 蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各用药组 ERK1、c-myc蛋白表达水平显著降低（P<0.05，P<0.01）。其中， 高剂量组ERK1、c-myc蛋白表达水平降低明显，低剂量组 变化差异最小。
讨论
现代医学认为，VSMC增生迁移是ASO发病的关键环节。 VSMC通过收缩和舒张调节血管张力，并通过分泌和释放血管 调节因子维持血管的正常功能。正常情况下，血管内膜下层一 般不会有VSMC，然而在危险因素作用下，血管内皮结构和功能 受损，导致血管活性物质和细胞因子特别是生长因子的合成与 释放，它们作用于VSMC膜受体，并激活细胞内信号传导通路， 最终导致核内基因的表达而促进VSMC的过度增殖并向内膜迁 移，从而使血管内膜增厚，AS斑块形成，甚至管腔狭窄，导致 ASO的发生。
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