生物絮凝剂一般来自微生物胞外分泌物，它 的优势体现在生物来源，具有绿色、易降解、无二 次污染特点。目前已经广为使用的利用活性污 泥中的微生物处理生活污水，就是微生物代替化 学物质用于环境处理的成功范例，在活性污泥中 存在着生物絮凝菌，它们利用自身分泌的胞外物 质结合污水中的悬浮颗粒，形成大的絮凝团，加速 污泥沉降，同其他细菌、真菌和原生动物一起，去 除污水中的有机物，降低污水的 ＣＯＤ 和 ＢＯＤ 指 标以达到出水标准。
１ 材料与方法
１．１ 材料
活性污泥：采样自低温生物反应器填料池；低 温生物膜：采样自低温生物反应器污泥回流装置； 低温生物反应器运行在哈尔滨工业大学环境工程学院实验室。 供试仪器主要有紫外分光仪（普析通用仪器 有限责 任 公 司）、超 净 台 （苏 州 净 化 设 备 有 限 公 司）、恒温培养箱（上海南荣实验设备有限公司）、 灭菌锅（日 本 三 洋）、电子 天 平（ＭＥＴＴＬＥＲ）、磁力搅拌器 （其林贝尔仪器制造有限公司）、电 泳 仪（北京 六 一 仪 器 厂）、ＰＣＲ 仪 （德 国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司）、ＢＩＯＬＯＧ 微生 物 自 动 鉴 定 系 统（美 国 Ｂｉ－ ｏｌｏｇ 公 司 ）、凝 胶 成 像 系 统 （美 国 ＵＬＴＲＡ－ ＬＵＭ）。
１．２ 方法
１．２．１ 絮凝细菌的分离和筛选
用离心管称取 活性污泥或生物膜各１ｇ，漩涡振荡１０ｍｉｎ，然后 用灭菌蒸馏水进行梯度稀释，取稀释倍数为４、５、 ６的样品涂布于ＬＢ培养基、牛肉膏蛋白胨培养基 和葡萄糖培养基，分别在４和３０℃的培养至长出 菌落，挑取单菌落，平板划线分离纯化菌株。纯化 后菌株采用试管斜面保存、编号。 挑取上面纯化后菌株接种于筛选培养基（葡 萄糖２％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％，ＮａＣｌ ０．０１％，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０２％，尿素 ０．０５％，酵母 膏０．０５％，ＭｇＳＯ４０．０２ ％）中，４ ℃培养７２ｈ，取 发酵液进行絮凝效率检测。检测方法为：取２ｍＬ 发酵液，加 入 ５０ ｍＬ 含 有 高 岭 土 ０．４％、ＣａＣｌ２ ０．０４％的水悬浊液，磁力搅拌器上以２５０ｒ·ｍｉｎ－１ 搅拌 １ ｍｉｎ，再 以 ６０ｒ·ｍｉｎ－１ 搅 拌 ３ ｍｉｎ，静 置 ５ｍｉｎ后于液面下２ｃｍ 处取样，在分光光度仪上 检测其 吸 光 度 Ａ５５０ｎｍ值，另取一份不加发酵液 的 高岭土悬浊液作为空白，测得吸光度 Ｂ５５０ｎｍ值，根 据测得数据计算各菌株絮凝率。公式如下： 絮凝率（％）＝（Ａ－Ｂ）／Ａ×１００。
１．２．２ 絮凝细菌的菌种鉴定
菌种鉴定采用形 态学、生理生化实验和细菌１６ＳｒＤＮＡ 序列 分 析 ３种方法。革 兰 氏 染 色、菌 落 形 态、菌 体 形 态、和 生理生化实验方法均参照《微生物实验手册》。 Ｂｉｏｌｏｇ细菌鉴定方法根据仪 器 操 作 手 册，将 菌 株 Ｈ８制成适当浓度菌悬液，接种于９６孔细菌培养 板，培养４～２４ｈ，置于 分 光 光 度 计 中 检 测，计 算 机自动分析菌种指纹图谱并给出鉴定结果。 透射电镜（ＴＥＭ）观察：将 Ｈ８菌落滴到水中 制成菌液，静置至细菌单细胞扩散，取铜网吸附细 菌细胞后用醋 酸 铀 染 色３ ｍｉｎ，取下铜网晾干后ＴＥＭ 上观察并拍照。
２ 结果与分析
选择４ ℃对低温菌进行分离培养，同 时以３０ ℃培养作为对照，３０ ℃培养 条 件 下 平 板 菌落的数量和种类明显占优势。，活性污泥和生物膜中都含有一定数量可以在 低温下生长的细菌，根据３种培养基中菌落形态 的差别进行低温菌株纯化及保存，低温生物反应 器中共分离到６４ 株低温细菌，其中２９株来自活 性污泥，３５株来自生物膜。进一步的絮凝菌筛选 试验结果证 明 低 温 反 应 器 活 性 污 泥 中 大 约７９％ 的低温菌具有絮凝活性。生物膜中的低温菌是被固定在特定载体上，所以对菌株的絮凝性要求不 高，但是在初筛实验中发现１３株低温菌具有絮凝 活性，占分离菌株的３７％。絮凝性复筛主要考察 菌株絮凝稳定性和絮凝效率，选 取 絮 凝 率 超 过 ５０％的菌株，最后获得活性污泥中５株絮凝细菌，和生物膜中５株絮凝细菌，其中 Ｈ８、ＤＧ２和 ＤＮ１三株菌徐 凝，均 超 过８０％。Ｈ８菌株 在 低 温 下 生 长较 快，絮 凝 率 达 到 ８３．７９％ ，絮 凝 照 片菌株 Ｈ８的菌落呈圆形，有凸起，边缘光滑整 齐，乳黄 色，不 透 明，大 小 约３．５ｍｍ×３．５ ｍｍ。 革兰 氏 染 色 阳 性，菌 体 椭 圆 形，大 小 （０．１０± ０．０２）μｍ× （０．０６±０．００５）μｍ，无 鞭 毛、纤 毛（图２）。生理生化试验结果证明菌株 Ｈ８可以 水解淀粉、明胶，不能水解酪蛋白、纤维素，可发酵 乳糖产酸，不产生尿素酶，接触酶试验阴性，氧化酶试验 阳 性，可 还 原 硝 酸 盐，硫 化 氢 试 验 阴 性， ＩＭＶＩＣ试验中只有柠檬酸盐试验为阳性。
３ 结论
本试验从低温活性污泥和生物膜中共分离到 ７５株细菌，其中中温菌有４６株，２９株在低温下生 长的细菌。对分离到的细菌进行产絮能力的初筛 和复筛试验，共得到４株絮凝颗粒大，絮凝效果好 的高效低温产絮菌株，其中 ＤＧ２和 ＤＮ１来自 活 性污泥，絮凝率分别达到８７．３５％和８１．３３％，Ｈ８ 和 Ｈ１３来自生物膜，絮凝率分别达到为８３．７９％ 和７８．４４％。经多次重复试验证明 Ｈ８的絮凝性 ，且在低温下絮凝效果稳定，该菌为乳黄色圆 形细菌，表面光滑湿润且有凸起，不透明的革兰氏 阳性菌。
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