关于液质联用(LC/MS)的知识小分享

液相系统组件

  HPLC核心组件为进行混合物分离的色谱柱。流动相经由高压泵到达进样器，再流入色谱柱，最后进入质谱仪。

  让我们先从高压泵开始：该泵通过过滤器从流动相瓶中吸取溶剂，对溶液进行加压，使得溶剂能够克服柱填料以及管路的阻力，并将溶剂泵入进校器。虽然目前大部分仪器都含有脱气模块，但仍推荐采用超声法对流动相溶剂进行脱气，防止管路中出现气泡。HPLC系统常采用往复式活塞泵：它由钻出的金属体组成，以提供泵送腔，泵送腔在背面用特氟龙密封，通过特氟龙密封件驱动惰性活塞。带有止回阀的入口和出口端口允许溶剂进入和退出泵腔。入口止回阀关闭以防止在活塞行程的增压部分溶剂跑回溶剂库。同时，出口止回阀打开，允许溶剂输送到通往注射器的管路。当凸轮驱动马达将活塞拉回时，进油单向阀打开以容纳更多的溶剂，而出油单向阀关闭以防止加压溶剂从喷油器管路中流回。泵运行的关键是活塞和活塞密封。的泵活塞由绿宝石玻璃制成，通常被称为蓝宝石活塞。顺便说一句，蓝宝石活塞不是蓝色的，但它的名字有助于证明必须更换破损活塞的成本。活塞沿其驱动轴线方向具有很大的强度，但很容易在轴线上折断。大多数泵的设计是为了避免活塞抖动，所以见的破坏活塞的原因是密封上的缓冲器积聚和泵头拆卸时的破坏，以检查活塞的状况。

  密封是对泵运行至关重要环节。它是由一个聚四氟乙烯的圆环，内含一个中心有孔的嵌入式圆钢弹簧，泵活塞通过这个圆环。这种油炸圈形状的密封件适合在泵头后部的圆形凹陷中，不像密封件的厚度那么深。当泵头用螺钉固定在泵端面时，密封被压缩，弹簧挤压到泵活塞上。它在活塞的行程中前进和后退时，在活塞周围形成一个高压液体屏障。当活塞通过特氟龙密封时，泵腔中的液体润滑活塞，当活塞上的薄膜到达密封外侧时，液体蒸发。流动相中的缓冲剂或离子对试剂在活塞上结晶，在回程上被密封件擦去。如果它们不擦掉或没有被洗掉，它们就会堆积并将活塞变成一把锯子，锯子穿过特氟龙，产生泄漏，需要定期更换密封。密封更换是见的操作，如果不正确的话，会导致活塞断裂。

 驱动凸轮和压力传感器是影响泵运行的另外两个部件。这种类型泵的基本问题是脉冲。泵的一部分时间是向柱体加压和驱动溶剂，活塞的一部分时间是重新填充溶剂室。泵腔内压力上升和下降，导致通过出口单向阀输送的溶剂脉冲。通过使用反向多泵头、电子泵电机控制、脉冲阻尼三种方法克服了这一问题。如果有两个泵头在不同的时间通过T型管向同一溶剂管线供料，脉动减小。其中一个可以重新填充，而另一个则驱逐出溶剂。显然，这种方法通过添加组件和工程增加了泵的成本，但确实产生了的溶剂输送。通过对泵电机进行电子控制，使其在补料和再增压行程中加速运动，可以设计出在输送模式下花费大部分时间的单柱塞泵。这种泵浦仍然是脉冲的，但是脉冲性大大降低。它的性能不如一个好的双头泵，但它的建造成本明显较低。

  脉冲阻尼器是减少液体脉冲的最后组件。没有厂家愿意承认其泵需要脉冲阻尼器，但所有厂家都使用。在泵的出口阀和进样器之间有两条线进出金属的装置可以是压力传感器、压力传感器或脉冲缓冲器。在高压泵上切开脉冲缓冲器，你会发现它包含一个非常细的内径不锈钢油管的长的、压缩的线圈。当脉冲发生时，这个螺旋管拉伸然后再次压缩，通过弹簧效应阻尼脉冲。压力变送器也有油管进出和信号线出来。内部是带有传感器的弯曲的油管线圈。随着压力的增加，管路发生拉伸，这种偏转可以通过传感器测量，并将信号发送到泵前的压力表。在进行需要惰性条件的分离时，重要的是要理解这些装置是存在的。两者都含有不锈钢，可以被高浓度的盐腐蚀，并且可以污染金属敏感的酶纯化物。

  HPLC系统中的第二个硬件部件是进样器。活塞式进样器是的进样器类型。在阀门的一个位置，来自泵的高压液体流经内部旁路流出至HPLC柱。阀门的另一侧连接小口径回路、注入口和废液排出器。

  溶解在流动相中的样品从注射器注入到定量环中，使定量环过量至少20 %。也可以使用部分进样，只要缓慢进样并保持不超过循环体积的75 %，以避免从进样口丢失样品。接着，将注射器手柄快速转动到注射位置。样品从环路后端洗出，给予次进样/先出样以维持样品浓度。自动进样器通常采用这种类型的回路和阀门布置，尽管它们可能将样品拉入回路而不是推入。他们还使用多种清洗方案，以避免从瓶子移动到瓶子进行后续注射时的样品携带污染。

  HPLC系统中的第三个硬件部分是检测器。在LC / MS系统中，这将是质谱仪的检测器之一，但其他HPLC检测器可能被用于从色谱柱的同一溶剂流中，或者与质谱仪串联，或者使用分流器将部分或大部分流出液分流到二级检测器，如折射率( RI )检测器、电导率检测器、紫外( UV )检测器或荧光检测器( FL )。所有这些二级峰检测器必须使用非常低的死体积流通池，以防止分离的色谱峰重新混合或用流动相稀释。每一个都提供了峰成分的额外信息。折射率和电导率检测器主要是质量检测器，其峰面积(或高度)与每个峰中物质的量成正比。荧光计对吸收紫外光的特定材料发生反应，并在较高波长处重新发射。紫外检测器是的HPLC检测器。可变探测器可以设置为只在特定波长下吸收的化合物，而二极管阵列紫外探测器可以在阵列可用的波长范围内检测吸收紫外光的化合物。

LC / MS系统的个硬件部分是一台计算机，用于数据采集和处理。同进用于控制所有系统模块和获取峰数据，量化峰面积，确定每个峰的组分分子量，识别杂质，并将峰的裂解规律与已知数据库进行比较，以确定目标化合物。

梯度洗脱与等度洗脱系统

到目前为止，我们只描述了一个非常简单的液相系统 ，一个便宜的单泵等度洗脱系统，能够泵出一个不变的流动相。改变储库中的溶剂可以产生溶剂的阶梯梯度，用于洗脱或洗脱后期运行的峰。对于许多专用的应用程序，这可能是所需要的全部。复杂的溶剂分离和方法开发需要一个更复杂的系统。相比于等度洗脱，梯度洗脱系统能够实现更复杂混合物的分离。梯度系统对色谱柱上的物质产生可重复的、连续变化的流动相组成。种方法是添加第二个溶剂泵和贮液器、混合器和泵流量控制器，使一个泵的速度增加而另一个泵的速度减慢，产生双泵梯度系统。溶剂的混合是在泵出口的高压侧进行的，因此任何可能由混合热释放的溶解气体都被迫返回到溶液中，直到它们退出检测器流通池。第二种共梯度系统仅使用单个泵，但增加了多个贮液器、连接它们的可编程开关阀、混合器以及控制泵流量和开关阀的控制器。该系统的优点是它的成本较低，因为只需要一个泵，并且有两个以上的流动相可用于生产梯度，用于方法开发和自动柱洗脱。

  在其他因素相同的情况下，由于开关阀梯度系统在价格和性能上的优势，在任何情况下都是理想的选择。然而，该系统产生的梯度不如双泵梯度系统产生的梯度精确或可重复。开关阀梯度系统还需要用氦气对储液器溶剂进行脱气。切换阀-混合器组合中溶剂混合不脱气产生的热量会导致泵头中空气被抽出溶液，造成空化，气塞堵塞溶剂输送至色谱柱。当泵活塞通过进气阀拉入溶剂时，空气中的氧氮混合气在溶剂中形成大气泡粘附在泵表面。氦在活塞行程的压缩部分形成小的、不粘的气泡，被迫返回到溶液中。

  大多数开关阀系统提供了3个和4个溶剂库，但3个和4个溶剂梯度的方法开发非常复杂，以至于很少看到超过一个双溶剂法的梯度，并且可能从第三个溶剂库中添加另一个溶剂。第三种和第四种溶剂的主要用途是用于自动化的色谱柱清洗和方法筛选，这两种溶剂在用于LC / MS分析之前可能会被淘汰。从第三个储库中加入恒定水平的挥发性缓冲液可能是在LC / MS操作中保留的一种用途。

  涉及极性和挥发性范围宽的溶剂的梯度方法向质谱仪接口提出了问题。接口的目的是双重的。在不损失分析物的情况下，必须尽可能地除去溶剂，并使其组分挥发和电离，以传输至质谱仪。在分离过程中，如果流动相中含有过宽的极性变化，溶剂可能不能被除去，并且会抑制界面的电离和质谱中的离子检测。出于同样的原因，涉及非挥发性缓冲液或离子对试剂的梯度在用于LC / MS之前必须作出一些调整。