细胞培养常见问题和解决方法

问题1：培养液pH值变化太快

可能原因

(1)CO2张力不对

(2)培养瓶盖拧得太紧

(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足

(4)培养液中盐浓度不正确

(5)细菌、酵母或真菌污染

建议解决方法

(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。

(2)松开瓶盖1/4圈。

(3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。

(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。

(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变

可能原因

(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来

(2)冰冻保存培养液

建议解决方法

(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。

(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。

问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化

可能原因

细菌或真菌污染

建议解决方法

丢弃培养物，或用抗生素除菌。

问题4：培养细胞不贴壁

可能原因

(1)*消化过度

(2)支原体污染

(3)培养瓶瓶底不干净

(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)

(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当

(6)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)

(7)接种细胞起始浓度太低或太高

建议解决方法

(1)缩短*消化时间或降低*浓度。

(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶

(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)

(5)重新配置消化液或培养液

(6)启用新的保种细胞

(7)调节*接种细胞浓度

问题5：悬浮细胞成簇

可能原因

(1)培养液中含钙、镁离子

(2)支原体污染

(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释

(4)DNA污染

建议解决方法

(1)用无钙镁*洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。

(2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。

(3)用DNase I处理细胞。

问题6：原代细胞培养物污染

可能原因

原代培养组织在进入培养前已污染

建议解决方法

培养前用含高浓度抗生素的*反复冲洗组织。

问题7：培养细胞生长减慢

可能原因

(1)由于更换不同培养液或血清

(2)培养液中一些细胞生长必需成分如*或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。

(3)培养物中有少量细菌或真菌污染

(4)试剂保存不当

(5)接种细胞起始浓度太低

(6)细胞已老化

(7)支原体污染

建议解决方法

(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。

(2)换入新鲜配制培养液，或补加*及生长因子。

(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。

(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清*培养液在2-8℃保存，并在2周内用完。

(5)增加接种细胞起始浓度。

(6)换用新的保种细胞。

(7)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。

问题8：培养细胞死亡

可能原因

(1)培养箱内无CO2

(2)培养箱内温度波动太大

(3)细胞冻存或复苏过程中损伤

(4)培养液渗透压不正确

(5)培养液种有毒代谢产物堆积

(6)更多原因参考问题4和问题7

建议解决方法

(1)检测培养箱内CO2

(2)检查培养箱内温度

(3)取新的保存细胞种

(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260– 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。

(5)换入新鲜培养液

(6)更多解决方法参考问题4和问题7