免疫组织化学方法

1、基本原理

　　酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性的单克隆抗体，是特异性强的价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在*抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组织化学间接染色法。

　　（1）标本的制备和处理

用于酶标抗体组化技术的标本有组织切片（冷冻切片和石蜡切片）、组织压印片。标本的制作和固定与荧光抗体技术相同，但尚需要一些特殊处理。

　　（2）标记酶

　　用于标记的酶应具备以下几点：

　　① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜下观察。

　　② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位。

　　③ 较易获得的酶分子，有商品出售。

　　④ 中性 pH 时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存 1-2 年活性不应改变，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

　　⑤ 酶标过程中，酶与抗体连接，不能影响二者的活性。

　　⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

　　其中 ① 、② 两点zui重要，因为容易显示的酶并非均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是zui常用的一种酶。

　　除 HRP 外，碱性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也较常用。

　　（3）底物显色剂

　　① DAB （3，3-二氨基联苯胺）：显色后阳性反应产物呈棕褐色。

　　② AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。

　　2、以 PRRSV 为例介绍一下染色程序。

　　（1）切片准备：将低温保存的切片37 ℃预热 5分钟 。

　　（2）常规脱蜡： 二甲苯15分钟； 乙醇 5分钟；乙醇1分钟；90% 乙醇 1分钟；75% 乙醇 1分钟。

　　（3）抑制内源酶：1% 盐酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 盐酸）作用10分钟； 3%过氧化氢水溶液作用15分钟。

　　（4）蒸馏水洗 2 次。

　　（5）用 0.05% *37 ℃消化2分钟。

　　（6）PBS洗2次，擦干周围后用组化（蜡）笔沿切片周边画一个圈 。

　　（7）封闭：正常马血清1：20倍稀释， 37 ℃ 孵育20分钟。

　　（8）加一抗（1 : 800倍稀释的PRRSV单克隆抗体 Mab 11），37 ℃孵育1小时或37 ℃孵育0.5小时后4 ℃过夜。对照片不加一抗。

　　（9）PBS 洗 3 次。

　　（10）加二抗（HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀释）37 ℃孵育1小时。

　　（11）PBS洗3 次。

　　（12）加AEC显色5~10分钟。

　　（13）苏木素衬染10秒钟。

　　（14）自来水洗2分钟。

　　（15）待切片自然干燥后用水溶性封片剂封片。

　　（16）镜检、观察记录结果。