原代细胞核基质的制备

原代细胞核基质的制备 

试剂和器材：
1. 硫酸铵（含10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）及0.2mmol/L MgCl2的1mol/L与0.2mol/L硫酸铵溶液）；
2. 氯化镁（1mol/L储存液）；
3. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（无水乙醇配制的1mol/L储存液）；
4. 纯化的细胞核保存于含0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、5mmol/L MgCl2的溶液中；
5. DNA酶Ⅰ；
6. Tris-HCl（1mol/L储存液，pH7.4）；
7. 悬浮缓冲液（SB）：5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl，pH7.4（含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟）；
8. Triton X-100；
9. 低速离心机，配有固定角转子和离心管；

实验方法：
所有的试剂置于0—4℃，并且所有操作均在0—4℃完成。
1. 向核悬液中加入Triton X-100使其浓度达到1%（体积分数），孵育30min同时用移液器小心混匀，以免产生气泡；
2. 1000g离心10min，弃去上清。用悬浮缓冲液小体积重悬提取的核沉淀（如5ml）；
3. 用DNA酶Ⅰ（30U/mg　DNA）消化细胞核30min；
4. 通过缓慢添加1mol/L硫酸铵溶液来增加盐浓度，使其zui终离子强度达到0.6（0.2mol/L 硫酸铵），加入0.2mol/L硫酸铵使体积达到40ml，然后孵育30min；
5. 1000g离心15min沉淀核基质，弃去上清；
6. 用悬浮缓冲液重悬沉淀，用相差显微镜或薄片电镜检测获得的产物；