小量全血DNA提取方法

小量全血DNA提取方法

储存事项:
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量（20微升）分装冻存，－20℃保存。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
? 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：*次使用前请先在漂洗液WB中加入量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
1. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5ml离心管。
如果全血起始量小于200μl，则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1ml之间，则需要*行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。
2. 加入20μl蛋白酶K （20mg/ml）溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10分钟。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。
可选步骤，一般不需要: 如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A（25mg/ml）溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
3. 冷却后加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
4. 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。
6. 加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
7. 加入500μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
8. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是zui小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
10. DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
? 附录（以300μl，1ml全血举例红细胞裂解操作）：
1. 吸取900μl红细胞裂解液到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。（红细胞裂解液可向本公司购买）
2. 将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中，颠倒6-8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞）。
4. 12,000 rpm离心20秒（对于1.5ml离心管）或2,000-3,000 rpm离心5分钟（对于15ml离心管），倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。