*酰基转移酶elisa试剂盒检测相关表达和调控

*酰基转移酶(Acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase，ACAT)是细胞内*催化游离*和长链脂肪酸合成*酯的酶，在体内*代谢平衡过程中起到关键的调控作用。细胞内ACAT活性与细胞膜微结构域功能、高*血症、动脉粥样硬化早期病变泡沫细胞形成等直接相关。因此，上普遍认为ACAT及其功能作用过程是重要的药靶系统。在实验室研究积累的基础上，我的博士论文工作主要探索人ACATl表达在RNA水平的调控与在细胞水平的功能。
　　 实验室前期工作表明，人ACATl低活性56-kD和高活性50-kD异构体分别从其mRNA的GGC1274-1276和AUG1397-1399密码子起始产生，而此对应于cDNA K1的mRNA含有可选择性长5’-非翻译区序列(5’-UTR,It1-1396)。本工作主要是探索来源于人7号和1号两条染色体的该5'-UTR序列对ACATl mRNA稳定性和蛋白表达的影响。首先，构建含有不同长度5'-UTR序列的人ACATl基因及其N端产物编码序列与荧光素酶基因的表达质粒并转染AC29细胞，分别用Western blot和RT-qPCR检测相应的蛋白表达和mRNA量。结果显示，人ACATl mRNA的可选择性长5'-UTR能非常显著降低ACAT150-kD异构体及其N端产物与荧光素酶蛋白的表达，同时非常显著降低其mRNA的量，且长5'-UTR对mRNA稳定性的影响远大于对翻译效率的影响。接着，利用ActD处理转染的细胞，抑制转录活性的结果显示，人ACATl mRNA的可选择性长5'-UTR明显促进其mRNA的降解。进而，制备体外转录的RNA分别进行细胞质转染和细胞核转染的实验结果显示，在细胞核内和细胞质中，含有长5'-UTR的mRNA降解速率都比不含长5'-UTR的快。这些结果说明，人ACATl mRNA的长5'-UTR主要通过促进其mRNA decay而调控ACATl表达。进一步，通过含有长5'-UTR中7号和1号染色体来源序列缺失突变的质粒转染细胞进行一系列实验，揭示了7号染色体来源序列促进其mRNA快速降解、1号染色体来源序列反而增强其mRNA的稳定性的decay机制。这部分研究工作，为人ACATl mRNA转录后的跨染色体剪接及其调控机制提供了新认识，也可为ACAT精细调节人细胞*代谢平衡研究提供重要的分子基础。
　　 在包括上述ACAT1分子水平调控等研究基础上，利用无明显ACAT2表达的神经细胞，深入探索ACAT1活性引起其底物游离*变化的功能。首先，利用ACAT抑制剂CP-113818处理神经细胞SK-N-SH，Filipin染色和细胞质膜游离*测定的结果均显示，ACAT1活性抑制引起细胞质膜游离*量显著增高，具有时间和剂量依赖性。同时，用Western blot检测细胞质膜APPα-型加工产物sAPPα的结果显示，ACAT1活性抑制引起APPα-型加工减少，也具有时间和剂量依赖性。并且利用CDX depletion细胞质膜*的结果证实，ACAT1抑制引起细胞质膜游离*量提高而导至APPα-型加工减少。以上结果表明，ACAT1引导神经细胞质膜游离*量而影响APPα-型加工。深入利用LPPS和Lova抑制细胞*的吸收、外运与合成代谢的结果显示，在细胞*较低水平条件下，ACAT1活性抑制仍能提高细胞质膜游离*量；而且在此条件下利用LDL或Mev增加细胞*的吸收或合成，也均无明显影响ACAT1引导质膜*量的变化。这些表明，ACATl引导神经细胞质膜游离*量具有很强的特异性和发挥重要功能作用。进一步，通过利用化合物U18666A抑制*转运至细胞质膜的NPC依赖途径等深入实验，发现ACAT1活性引导细胞质膜*量，还通过非NPC依赖的*转运途径。深入通过ACAT1的RNAi和过表达及胚脑组织培养等实验，证实了人ACAT1表达调控可引导神经细胞质膜游离*量而发挥其在细胞水平的功能作用。这部分工作，建立了一种ACAT1表达的细胞水平功能研究新体系，可促进拓展ACAT引导细胞质膜游离*的动态变化等前沿性探索。