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甲醛洋菜胶体电泳

时间:2010-12-7阅读:408
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甲醛洋菜胶体电泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)甲醛是一种常用的RNA 变性剂。在进?分析时,必须先配制含有甲醛的洋菜胶体,RNA 也必须先以甲醛及formamide 进?变性处?,以确保其二?结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质,配制胶体及进?电泳分析时?应在抽气橱里小心操作;进?电泳时所使用的缓冲液为MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)。此外,含有甲醛的洋菜胶体比较??,容?破?,在移动胶体时应特别??。由于rRNA 占细胞RNA总?的80~85%,以ethidium bromide 染色后,呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs (真核生物为28S 与18S,原核生物为23S 与16S);散布于small rRNA 附近,呈淡淡smear 的就是mRNAs,这是因为mRNAs 存在??多,而且长??一的缘故。长?较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。

 
    仪器用具:65℃恒温水槽;微?离心机;Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器;UV transilluminator;防护面罩;拍?得相机;抽气橱
 
 
    药品试剂:
    自菌体抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 与胞外转录反应所制备的正意股及反意股RNA (#1, #2, #3, and #4)。
    5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)
    Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA)
    Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)
    dH2O/DEPC
 
    方法步骤:
    ◆ 注意:
    a. 下?实验主要参照Sambrook and Russell (2001) 的方法。
    b. 进?下?实验时请务必戴手套。
    c. 甲醛与formamide ?放在抽气橱内。
    准备一片1.2%甲醛洋菜胶体:
    1) 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶,加入25 mL dH2O/DEPC。
    2) 以微波?加热溶解的后,微微晃动血清瓶使混合均匀,再移至60℃恒温水槽静置5 min。
    3) 将装着agarose 溶液的血清瓶移至抽气橱,加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛,轻轻摇晃血清瓶以?混合均匀。
??  胶体总体积为40 mL,为?避免agarose 溶液因温?快速下?,很快?凝固,应?求动作迅速,但应避免剧?摇晃,以免?出一大堆气泡,影响胶体凝结。
    4) 尽速于抽气橱内把混合液倒入胶体铸模,并插入样本梳 (teeth comb)。胶体凝固至少需时30 min。
    电泳:
    1) 要进?电泳时,把已凝固的洋菜胶体放进电泳槽,并加入适?1×formadehyde gel running buffer。
    2) 以50 V 定电压预跑5 min。
    3) 依序注入上?8 个RNA 样本,以50 V 定电压进?电泳,待追踪染剂移动至胶体三分的二处时,关闭电源,将胶体移至UV transilluminator box,观察RNA 色带的存在情形,并拍照存证。
??  注意:这一片胶体往下将用?进??方转印实验,请小心处置!
 

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