百蕊生物：AMP含量试剂盒现货供应

AMP含量试剂盒说明书
测定意义：
AMP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定AMP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
测定原理：
AMP在254 nm下有吸收峰，可以利用液相色谱法测定其含量。
需自备的实验用品：
液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器（水系，50个，0.22μm）、滤膜（水系和有机系各1个，0.45μm）、C18柱（4.6 ×150 mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、甲醇（色谱级，300 mL）和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂1×1瓶，粉剂2×1瓶，4℃保存；临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，形成流动相缓冲液基质（注：试剂瓶中的粉剂要冲洗干净）, 4℃可保存1周；
试剂四：AMP标准品5mg×1支，-20℃保存。临用前加入1mL双蒸水，配成5mg/mL 溶液，配好后-20℃可保存1周；
实验前的准备工作：
1、将双蒸水1000 mL、流动相缓冲液基质1000 mL和甲醇300 mL用0.45 μm的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。
2、流动相的配制：将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000 mL与甲醇配比为99.9：0.1（v/v），即取999mL缓冲液基质与1mL甲醇混合。
3、将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成的甲醇， 10%的甲醇，双蒸水各250 mL。
将2和3中的溶剂超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。
AMP的提取：
1、组织的处理：准确称取组织重量0.1g，加入1mL试剂一，提取AMP， 4000 g常温离心15 min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000 g，常温离心15 min，取上清，0.22μm水系微孔滤膜过滤后冰上放置，待测。
2、细胞处理：收集约30 mL细胞，离心菌体经干燥后，加入1 mL 试剂一，超声破壁细胞(950 W，30%，15 min，工作1 s间隔2 s)，4000 g，常温离心15 min，取上清液，加入等体积的试剂二，混匀，4000 g，常温离心15 min，取上清，0.22μm水系微孔滤膜过滤后冰上放置，待测。
AMP含量测定操作步骤：
1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开empower软件，在方法组中设置进样量20 μL，流速1 mL/min，保留时间10min，检测波长254nm,设置完毕保存方法组。
2. 用的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。
3. 用流动相洗柱子，待基线稳定后开始加样。
4. 加入标准品20 μL，在10min内可分离AMP， AMP的保留时间在7min左右（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的AMP标准品的峰面积。
5. 加入样品20 μL，在相应保留时间处检测AMP的峰面积。
AMP含量的计算：
将5mg/ml的AMP标准品用双蒸水分别稀释成100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg /ml、40 μg /ml和20 μg /ml的AMP标准品溶液，以标准品浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标分别计算AMP标准曲线。
注：标准品的稀释倍数要根据样品中AMP浓度确定，样品中AMP的峰面积必须落在不同浓度的AMP标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。