ELISA酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.分类和操作原理
       酶联免疫吸附试验或称酶联免疫吸附测定法。是当前应用zui广泛的一种测定方法，它是以物理方法将抗体（或抗原）吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学和生物化学反应都在此固相载体上进行，免疫酶测定试验包括间接法、双抗体夹心法和竞争法以及近年来发展的一些改良法。
（1）间接法：将已知抗原吸附（或称包被）于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗除未起反应的物质，加入酶标抗体同种球蛋白（如被检血清是兔血清，就需用抗兔球蛋白），感作后再经洗涤，加入酶底物，底物被分解，出现颜色变化，颜色变化的速度及程度，与样品中的抗体量有关，即样品含有抗体愈多，颜色出现得也愈快、愈深。
（2） 双抗体夹心法：是检测抗原的方法，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗体在固相表面上形成复合物。洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后漂洗，加入酶底物，颜色的改变与待测样品中的抗原量成正比。
（3）竞争法：利用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有*抗体的原理，测定样品中的抗原。操作时需要有只加酶标记抗原的系统作为对照。将抗体吸附于固相载体表面，感作后漂洗，加入待检抗原样品和酶标记抗原（也可先加待检样品，稍后再加酶标记抗原）。对照则只加酶标记抗原。感作后漂洗加入酶底物溶液。含酶标记抗原的对照系统出现颜色反应。而在待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制颜色反应。待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，所形成的不带酶的抗原抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，从而使酶催化底物时产生有色产物的量也减少，而带酶复合物量却相对增多，酶催化底物时产生有色产物的量也增多。因此，待检系统中颜色变化的程度与其中抗原的含量成负相关。
此外，免疫酶染色法中抗酶染色法的免疫球蛋白桥法和PAP法等也都可以用于酶联免疫吸附测定，除以上这些基本方法之外，科学工作者又在此基础上，通过“技术杂交”设计出了许多改良方法，举例如下：
阻断ELISA：将已知抗原包被于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入被检血清，感作后洗去未起反应的物质，加入抗已知抗原的酶标抗体。感作后再洗涤，加入酶底物，底物颜色变化的速度与程度，与被检血清中的抗体量有关，样品中含有的抗体愈多，与固相载体上抗原结合得愈多，剩下给已知抗体结合的位点愈少，颜色出现的愈慢、愈浅。
夹心间接ELISA：本法主要应用酶标记抗抗体测定抗原。先将特异性抗体（如兔IgG）吸附于固相载体表面，孵育后冲洗，随后加入待检抗原样品，感作后冲洗。再加入不同种动物（如豚鼠）的相同的特异性抗体。感作冲洗后，加入酶标记抗第二种抗体的动物球蛋白（如兔抗豚鼠免疫球蛋白）。再行感作冲洗后，加入酶的底物。其所产生的颜色变化与第二步中加入的抗原量成正相关。由于预先吸附在固相载体表面的抗体能够特异性地捕捉标本中的抗原，所以，这种方法又称为抗原捕捉ELISA（AC—ELISA）。
抗体捕捉ELISA：主要应用于IgM的检测。它可以解决由于IgM在液体中含量较低，用常规间接法测定常不能获得满意效果的问题。抗体捕获ELISA的操作原理是：首先用抗u链抗体（是单抗）包被载体，随后加入待检体液（血清或脑脊髓液等），感作后冲洗，再加入酶标抗原或抗原～酶标抗体复合物，再行感作冲洗后，加入酶的底物。反应产生的颜色变化与体液中的特异性IgM含量成正比。
一步法ELISA  ：本法是双抗体夹心法的拓展，其基础是分别使用针对不同抗原决定簇的单克隆抗体包被载体和进行酶标记。具体方法是用针对待检抗原不同抗原决定簇的一种或几种单克隆抗体包被载体，包被完毕的载体经适当处理可长期保存或作商品供应。检测时，同时加入被检标本和酶标记的针对待检抗原的另一种或几种抗原决定簇的单克隆抗体，感作后冲洗，再加入酶作用的底物，反应所产生的颜色变化与待检抗原的含量成正比。本法由于待检抗原和酶标抗体同时一步加入，故称一步法，其优点是操作十分快捷，一般可在1小时内得出结果，某些商品化的一步法ELISA系统，整个检测只需几分钟。
2.ELISA的操作要领
（1）固相载体的选择：目前广泛应用的固相载体是聚苯乙烯微量反应板，有的供应商还把聚苯乙烯制成条或小杯，可随意组合应用。另一种广泛应用的固相载体是PVC塑料软板。这些材料的吸附效果与塑料的类型、表面性质有关，生产加工工艺的不同以及其他选择性能好的固相载体。吸附性能可用以下方法测定：在固相载体的每一个小孔中，加入同一份同一稀释度的抗原或抗体，使之吸附于小孔表面，然后按常规方法操作，加底物显色后测定每一孔中溶液的A值。一般认为，每两空的A值误差均在±10％内，否则不可使用。
固相载体用标准阴、阳性抗体或抗原孔的光密度差值要大，二者相差10倍以上属合格。
近年来，还有一些研究人员应用硝酸纤维素膜作为ELISA的载体，直接在膜上点样，进行一系列的操作，结果表明这种载体使用方便，敏感性、特异性等并不亚于用塑料作载体的ELISA试验，由此衍生出了斑点—ELISA（Dot—ELISA）。还有人用疏水聚酯布作为ELISA载体，使ELISA结果更易保存，由此衍生出了布—ELISA（C—ELISA）。
（2）预备试验：在正式进行ELISA试验前，必须进行预试验以确定酶结合物，包被抗原或抗体的zui适浓度、底物的zui适反应时间等。
酶结合物的确定：以pH9.6的碳酸盐缓冲液将IgG稀释至100ug／ml，加入固相载体的每一孔中进行包被，洗涤后将酶结合物以1：200、1：400、1：800、……作系列稀释，依次加入各孔，每一稀释度加2孔。反应完毕后加底物显色，读取结果，以能产生光吸收值（A）为1.0的稀释度为结合物的zui适浓度。
包被蛋白质浓度的确定：酶结合物浓度确定后，应测定包被蛋白质（抗体或抗原）的zui适浓度。其步骤是：将欲被包被的蛋白质用pH9.6的碳酸盐缓冲液作1：10、1：20、1：40……系列稀释，以每一稀释度包被固相载体的2个孔，然后进行常规的ELISA操作。zui后读取结果，同样以能产生光吸收值（A）为1.0的稀释度为包被蛋白质的zui适浓度。
底物zui适作用时间的确定：以zui适稀释度抗原和酶结合物进行试验，加入底物后在不同时间终止反应，即可确定zui适反应时间。
（3）包被：将蛋白质（抗原或抗体）吸附于固相载体表面的过程称为包被。除应注意选择合适的载体外，还应注意：
包被液的pH：通常用pH9.5～9.6，0.05mol／L或0.1mol／L的碳酸盐缓冲液稀释抗原或抗体，吸附时的pH一般为9.0左右。如pH较低，则吸附时间延长，但pH低于6.0则非特异性吸附增加。
吸附时间与温度：一般为4℃过夜，有时也可采用37℃吸附1～5小时。
蛋白质液：在固相载体上，每孔加入量一般为0.1～100ug／ml。若浓度太高，会因抗原或抗体蛋白分子之间的相互作用较大而影响载体对蛋白质的吸附；如浓度太低，则敏感性下降。
对于细胞培养产生的病毒抗原，或其他高浓度抗原，也可试用下述方法进行包被，将细胞培养物或其他抗原液加入反应板的各孔后，每孔滴入1滴20％～25％的甲醛溶液，室温固定15分钟，其间不断温和地晃动。zui后用洗涤液或蒸馏水洗涤除去甲醛，包被即告完成，该法简便省时，包被效果确实。
（4）洗涤：在ELISA试验过程中，与免疫酶染色法一样，为了除去前一步所加的未结合的抗原、抗体或结合物，防止其与随后加入的相应物质或底物产生不应有的反应，则每一步都必须进行洗涤（清洗）。其方法是，先将载体各孔甩干，再加洗涤液充满各孔，静置3～5分钟，如此重复三次。然后将载体甩干，立即加入下一步的试剂。
目前较多使用的洗涤液是含有0.05％吐温-20，0.01mol／LpH7.4的PBS。应用含有0.05％吐温-20，0.01mol／LpH7.4的Tris—HCl效果也很好。
（5）封闭：抗原或抗体包被后，载体表面仍可能有未吸附蛋白质的空白位点，从而造成下一步的非特异性吸附，即使用较高浓度的蛋白质包被，也有必要对包被后的载体进行处理，以封闭可能存在的空白位点。常用的封闭液有：1％～3％牛血清白蛋白、3％～5％脱脂乳、10％牛或马血清等。加入封闭液后，可在37℃吸附2小时，然后洗涤。
（6）结果判定：ELISA结果的判定方法很多，常用的有以下几种：
目视比色法：在ELISA试验完成后，直接以肉眼观察反应产物的颜色变化，作出阴性或阳性的判断。这种方法主要用于ELISA的定性实验中。
光电比色法：用分光光度计在适宜的波长下测定反应后的光密度值，然后以下列方法之一对样品进行定性或定量：
a．值法：在小心控制的条件下，结果以值来表示。在抗体测定中，先确定未感染群体的值平均值（X），然后在此水平上选择一个指示感染值（一般是X±2SD或X±3SD），如果被检血清的值在该值之上，为阳性；在其下，为阴性。
b．P／N比法：即被检样品（P）的光吸收值（A）和阴性标准样品（N）平均（A）值之比，以大于某一比值（一般为≥2）为阳性。
c．终点法：所有血清通过连续稀释滴定，并测定每一稀释度的A值，根据阴性血清的测定结果，选定一个值（见值法），以产生这个值的稀释倍数作为“效价”。
d．单稀释法：被检样品不作连续稀释，而根据预试验的结果选择一个合适的稀释度。所有样品都按该稀释度稀释，反应后测定光吸收值，将此值与用标准样品作成的标准曲线比较，或用回归方程计算，得出被检样品的“效价”。有人将这种方法称为单稀释ELISA。

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