克伦特罗酶联免疫定量检测试剂盒使用说明书
概述:
克伦特罗（Clenbuterol）属于一类β-兴奋剂，具有改进脂肪型动物体内肉与脂肪的比例的作用，亦可促进动物生长。但同时，此药物还会使非横纹肌松弛，人体摄入后可引起心跳、心率不正常等副反应，甚至可导致心脏病。因此在我国，克伦特罗在畜牧业上的使用是被严格禁止的。
本试剂盒利用竞争酶联免疫法对生物样品中的克伦特罗进行定量分析。适用于动物尿液、血清、内脏等物质中克伦特罗的快速检测。由于ELISA法的高通量与简便快速，适合大量样本的定量筛查，自样本加入至结果读出，不超过60分钟，检测灵敏度为0.1ppb。
一、 简要原理
试剂盒所提供的微孔板上包被有抗体，然后将校准品或样本中的克伦特罗与酶标记的克伦特罗加入微孔中后，两者可竞争结合克伦特罗抗体，洗去未结合的酶标记克伦特罗。加入底物后，在酶作用下，底物溶液会显蓝色，加入终止剂后，溶液由蓝转为金黄色。在450nm波长光下测吸光度，吸光度高低与校准品或样品中克伦特罗的含量呈反比，根据校准品的读数作出校准曲线，并利用校准曲线计算出样品中克伦特罗的含量。
二、 试剂盒组成
1. 酶标反应板： 96孔易折板，抗体已包被
2. 克伦特罗校准品： 1ml/瓶×6瓶 浓度：0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3. 11×酶标记克伦特罗浓缩液： 1.2ml/瓶×1瓶（稀释11倍使用）
4. 底物液： 11ml/瓶×1瓶
5. 酶标稀释液： 20ml/瓶×1瓶
6. 50×浓缩洗涤液： 20ml/瓶×1瓶（稀释50倍使用）
7. 终止剂： 11ml/瓶×1瓶
8. 其他： 说明书×1份 自封袋×1个
2-8℃贮存，有效期一年
三、 实验需要但试剂盒不提供的试剂和仪器
1. 试剂
――――――10mM盐酸溶液
――――――氯化钠
――――――50mM PH7.0 PBS （配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml蒸馏水中）
――――――异丙醇
――――――乙酸乙酯
2 .仪器
――――――微孔板酶标仪
――――――涡旋振荡器或超声波粉碎仪
――――――离心机
――――――20μl、200μl、1ml移液器
――――――氮吹仪或旋转蒸发仪
四、 待测样品处理方法
1. 尿液
新鲜尿液可直接测定，如尿液混浊，则离心取上清进行检测。（如尿液中克伦特罗含量超出试剂盒线性范围,可用蒸馏水或50mM PH7.0的PBS对尿液进行适当稀释后再行检测）
2. 肉样及内脏组织
1）.称取肌肉或内脏样本10g，用20ml 10mM盐酸溶液匀浆，置于离心管中，充分振荡混匀5min或超声混匀5min,再静置10分钟。之后10000rpm离心10min或4500rpm离心20min（离心温度保持在10℃左右）。收集澄清的上清液（注意勿吸取脂肪层），可直接用于检测。（相当于0.5g样品/ml）
2）.若要获得更高的检测灵敏度，可在离心后收集所有上清，加入氯化钠固体至0.32g/ml，可能会有沉淀或乳化现象产生，请勿离心!将2ml上清转移至玻璃离心管中，加入4ml异丙醇+乙酸乙酯（2+3），充分振荡混匀5分钟,静置15分钟。提取完毕，3000r/min离心10min，将2ml上层有机相转移至玻璃试管中，用氮吹仪60℃吹干有机相，然后加入一定量的蒸馏水或 50mM PH7.0的PBS溶液将残留物溶解，待检（若复溶体积为0.5ml,则相当于1g样品/ml）
3. 动物饲料
称取5.0g研碎的饲料样品，加入10ml 5mM HCL，置于离心管中充分振荡混匀5min或超声混匀5min，再静置10分钟。之后10000rpm离心10min或4500rpm离心20min（离心温度保持在10℃左右），转移出上清液，可直接用于检测。
若要获得更高的检测灵敏度，可按“肉样及内脏组织”处理方法2）.中所述进行处理。（如*按前述处理,则复溶体积为0.5ml时，相当于1g样品/ml）
五、 试剂准备
1. 实验前准备
将试剂盒取出，室温（20-25℃）放置30分钟，使试剂盒回温。
2. 酶标记克伦特罗工作液准备
由于稀释后的酶标记克伦特罗工作液稳定性较差，所以请从试剂盒中取出所需量的酶标记克伦特罗浓缩液，用酶标稀释液以1:11的比例稀释浓缩酶标记液（例如80μl浓缩液+800μl样品稀释液）。
3. 洗涤液配制
取出所需量的浓缩洗涤液，加入49倍体积的蒸馏水，即成洗涤工作液（例如10ml浓缩液+490ml蒸馏水）
六、 操作步骤
1. 从锡箔袋中取出所需的微孔板条，将暂时不用的微孔板条放回带有干燥剂的锡箔袋中，并用试剂盒附带的自封袋封存。
2. 在一个微孔中加入150μl蒸馏水作为空白对照。
3. 其余各微孔中加入50μl克伦特罗校准液或已完成前处理的待测样品。
注意：加入校准液顺序为按照浓度从低到高加入，以避免校准液浓度出现偏差。
4. 每孔（除空白对照孔以外）加入100μl酶标记克伦特罗工作液（配制方法见五-2）
注意：在试剂加入过程中，请避免移液器滴头接触已加入的校准液或待测样品，防止孔间交叉污染；避免在加样过程中产生气泡。
5. 振荡混匀反应液，于20-25℃环境下放置30分钟（建议使用25℃恒温箱）。
6. 取出微孔板，倾空液体，每孔加入400μl洗涤液，轻轻振荡，静置片刻，倾去洗涤液，重复4次。zui后在吸水纸上将微孔板拍干。
7. 每孔加入100μl的底物液，20-25℃避光环境下放置20分钟（建议使用25℃恒温箱）。
8. 取出微孔板，每孔加入100μl反应终止液，充分混匀（微孔中切忌存在气泡），用酶标仪在450nm下读数，扣除空白，并绘制校准曲线。
七、 结果判定
1. 样本中的克伦特罗含量可以通过在半对数坐标纸木上手工绘制校准曲线来进行定量计算；或者应用合适的计算绘图软件绘制出校准曲线，得出公式，并计算样品中的克伦特罗浓度。
2. 先将除空白孔外的所有测定孔扣除空白对照的吸光度。然后将扣除空白后的校准品孔吸光度值 （B） 除以扣除空白后的阴性对照孔吸光度值 （B0） ，再乘以，即：
以所对应的校准品浓度为横坐标（x），绘制出校准曲线。
3. 用上述方法，同样地得出对于样本测定孔的y值，代入校准曲线，即可计算出相应样本的克伦特罗浓度值。以下为校准曲线的一个示意图：
八、 试剂盒相关方法学数据
1. 试剂盒灵敏度
本试剂盒灵敏度为0.1ppb
2. 试剂盒半抑制率
本试剂盒半抑制率约在0.7～1.0ppb左右
3. 试剂盒的重复性
对不同浓度的校准品进行8次重复测定，获得每个浓度所对应的OD450值，计算变异系数，结果如下：
4. 试剂盒线性范围
本试剂盒在0.2ppb～4ppb区间呈线性相关。
5. 添加回收实验的回收率
以猪尿为例，回收率在80～120%之间。
6. 交叉反应
结构类似物 交叉反应率
* 3.5%
特普他林 1.2%
异丙基肾上腺素 <0.1%
九、 实验中注意事项
1. 在试验前将所有试剂预热至室温。
2. 试剂加入各微孔的时间差越小越好，如果检测样本较多，建议使用多孔移液器。
3. 操作过程中手尽量少接触酶标板底部，并且在读数前用软纸轻轻擦去底部可能附着的水珠或指痕。
4. 在加入反应终止液后1小时内读数。
5. 本实验可采用单孔或平行双孔定量测定，但双孔定量更准。
6. 反应终止液为强酸物质，避免接触皮肤或衣物。
7. 不要使用过期试剂，不要将不同批号试剂混用，否则会造成灵敏度降低。
