ELISA试剂盒过碘酸钠氧化法

本法是目前ELISA试剂盒酶标记抗体较好的方法，能使70%酶与90%以上球蛋白结合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，FDNB）封闭HRP表面的游离氨基（亦可用甲醛或戊二醛来封闭），从而提高酶结合抗体球蛋白的能力，避免酶的自身交联。然后用过碘酸钠来氧化HRP表面结构的醣链部份（即低聚醣基团）使成醛基，使其直接与抗体球蛋白上的游离氨基形成共价键而结合。zui后用硼氢酸钠还原，使HRP表面醛基能充分与抗体球蛋白上氨基进行反应，使之形成稳定的结合物。其反应式如下:
               NH2                         N=CH2
（1）     Fe—E            +HCHO---->  Fe—E            +H2O
               CH2OH                       CH2OH
            N=CH2        NaIO4         N=CH2
   （2）   Fe—E             +O---->Fe— E               + H2O
                   CH2OH                     CHO
                 N=CH2                                                N= CH2  
（3） Fe—E           +H2N-Ig--->  Fe—E               + H2O
              CHO                          C=N-Ig
                                           H
ELISA试剂盒标记步骤是：10mg HRP溶于新鲜配制的0.3 mol/L PH 8.1*2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯无水乙醇溶液，室温中搅拌1小时以封闭HRP表面的游离氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，于室温中轻搅30分钟，用0.16 mol/L乙二醇溶液终止氧化反应。1小时后移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，除去试剂，透析袋中的即为醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗体球蛋白（用2ml碳酸盐缓冲液溶解），混匀，室温搅拌2-3小时后加10mg硼氢酸钠盐，4℃冰箱4小时或过夜。次日取出加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物（去游离酶），并用50%饱和硫酸铵洗涤1-2次。再溶于3ml PH 7.4 PBS中，并置透析袋经透析除盐，如有沉淀藉离心除去。上清酶结合物加入等量60%甘油PBS，分装保存，冰箱备用。
如采用改良过碘酸钠简化法制备酶结合物，比原法更简便、快速，所获制品质量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀，约5分钟后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱内20分钟，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml终止氧化反应，30分钟后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的无水乙醇（AR）沉淀醛化酶，离心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗涤一次后，离心倾去乙醇（尽量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸钠缓冲液2ml溶解，然后加入2ml羊或马抗人IgG（内含蛋白量20mg左右），搅拌均匀，置冰箱内过夜，次日取出加10mg NaBH4 混匀，3小时后加等量饱和硫酸铵沉淀酶结合物，离心，去上清，沉淀用50%饱和硫酸铵洗涤一次，离心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理盐水透析除盐（需换液5次），如有沉淀藉离心除去，上清呈淡棕色即为酶结合物。加60%甘油PBS，分装保存备用。
制备好的酶结合物，要作两者克分子比和使用稀释度的测定，标记率的测定（A403/A280—0.4—1.0为宜）。
1、酶结合物克分子比测定：将制备好的酶结合物经适当稀释在分光光度计中以280nm和403nm测O.D值，然后按下列公式计算两者的克分子比。
（1）酶戊二醛交联法的计算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4为酶O.D403nm=1.0时相当于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42为酶蛋白结合戊二醛后在280nm应有的O.D，抗体球蛋白0.62为蛋白质与酶--戊二醛结合后O.D280nm值约应以加6%，故以0.94校正之。换算系数，故zui后要乘于0.62。
（2）ELISA试剂盒用过碘酸纳氧化法的计算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3为酶蛋白本身在280nm应有的O.D值。
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶结合物的克分子比。