分享---测培养细胞中污染的支原体

PCR法
原理 该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16sr RNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。
u  16sr DNA引物用水稀释至40umol/L。
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
2）  PCR扩增
（1）  在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：
10X PCR缓冲液 5.0ml
25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul
40umol/L 16sr DNA引物 每种引物1.0ul
40umol/L pBR322 DNA 引物 每种 2.0ul
pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul
DNA聚合酶（5U/ml） 0.2ul
三蒸水 35.4ul
总量 45ul
（2）  用无菌去离子水稀释样品为1:10，1:100。
（3）  于每个eppendorf管中加45ul PCR扩增混合物，每管中分别加入样品原液及1:10，1:100稀释液各5ul，操作均在冰浴中进行。
（4）  在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。
（5）  将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令：
①  950C 10min 一个循环
②  950C，30S→580C 1min→720C 1min, 共30个循环。
③  zui后720C 10min延长循环。

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