ELISA的操作步骤

1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):

将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)

2. 封闭酶标反应孔:

5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.

洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤次数3次

3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):

检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.

将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min.

4. 加入酶标抗体:

酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行. 37℃,30-60min之间.短于30min往往结果不稳定.每孔加100μl.洗涤同前。

5. 加入底物液(现用现配):

TMB-过氧化氢尿素溶液,OPD-过氧化氢底物液系统次之.

底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分钟,加入终止液显色.

6. 终止反应:

每孔加入终止液50μl终止反应,于20min内测定实验结果.

7. 结果判断:

OPD显色后采用492nm波长,TMB反应产物检测需要450nm波长.检测时一定要首先进行空白孔系统调零.用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价.(数值的大小依具体检测要求而定.)

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