沪鼎生物丨ELISA实验小指南

酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。利用这种基于抗原抗体杂交的技术，我们可以量化检测可溶性物质，如蛋白质，在ELISA中，抗原作为目标分子，被固定在（特定的固相载体上），并被特异性的，与酶偶联的抗体检测，当提供无色底物时，酶产生可测量的有色底物。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。

酶联免疫吸附试验（ELISA）是血清学检测方法，既可以检测抗原也可以检测抗体，主要包括间接ELISA、竞争ELISA、捕获 ELISA以及双抗夹心ELISA。其中，间接 ELISA操作相对简便，结果清晰，在抗体的检测中最为常用。该方法灵敏度高、特异性好，并且可以实现批量检测，适合用于对临床样品的大批量检测。

实验步骤

间接法 - 常用于检测抗体

（1）按实验需求配置标准品，S0-S7；

（2）稀释待测样本和加样；

（3）配置抗体，加样，室温孵育1-2h；

（4）配置洗涤液；

（5）洗板；

（6）配置辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（HRP）；

（7）3次洗涤结束后，加入稀释后的 HRP 100L/孔，室温孵育1h；

（8）洗板；

（9）加底物溶液；

（10）加终止液；

（11）加入终止液，使用酶标仪测定各孔吸光值（OD 值）。

注意事项

温育是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。温育温度应在37℃，水浴。温育时间应按照试剂说明书上的时间严格执行。温育实际测定操作中要注意以下几点：

1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。温育时间不够，弱阳性样本测不出来。

2）因为采用水浴，所以在温育时一定要封板，防止水蒸气形成水滴掉入反应孔内造成污染，并有可能整板花板。

全自动洗板机的使用应注意以下几点：

1）洗板前，应检查洗液瓶、蒸馏水瓶是否充足，废液瓶是否满瓶。

2）在自检过程中注意观察洗液灌注是否通畅，排液是否通畅。3）在洗板过程中，应注意观察反应孔每孔是否灌满且无外溢，每孔吸水是否吸尽，并且要保证洗液在孔中放置的时间。如果手工洗板的话就更需要操作者的操作技巧。

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