苏州乾芸仪器科技有限公司
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阅读：622发布时间：2014-10-8
MTT完整汉语化学名为 3-(4，5-mtt二甲基噻唑-2)-2，五二苯基四氮唑溴盐，商品名：mtt噻唑蓝。是一种黄色彩的染料。
MTT比色法，是一种检查细胞存活和生长的办法。其检查原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT康复为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功用。二甲基亚砜(DMSO)，其作用是能够溶解细胞中甲瓒，用酶联免疫检查仪在490nm波利益测定其光吸收值就可反映活细胞数量。在必定细胞数方案内，MTT结晶构成的量与细胞数成正比。该办法已广泛用于一些生物活性因子的活性检查、大方案的抗肿瘤药物挑选、细胞毒性试验以及肿瘤放射活络性测定等。它的特点是活络度高、经济。缺点：因为MTT经康复所发生的甲瓒商品不溶于水，需被溶解后才调检查。这不只使工作量增加，也会对试验作用的准确性发生影响，而且溶解甲的有机溶剂对试验者也有危害。
MTT 溶液的制作办法
通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因而，能够称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培育基中，用0.22μm滤膜过滤以除掉溶液里的细菌，放4℃ 避光保留即可。在制作和保留的进程中，容器用铝箔纸包住。试验的时分我通常封闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需求留神的是，MTT法只能用来检查细胞相对数和相对生机，但不能测定细胞必定数。在用酶标仪检查作用的时分，为了确保试验作用的线性，MTT 吸光度在0-0.7 方案内。
MTT通常现用现配，过滤后4oC避光保留两周内有效，或制作成5mg/ml保留在-20度长期保留，防止重复冻融，小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光防止分化。我通常都把MTT粉分装在EP管里，用的时分现配，直接往培育板中加，没必要一瞬间配那么多,特别当MTT变为灰绿色时就必定不能再用了。
MTT有致癌性，用的时分留神,有条件带那种通明的簿膜手套.配成的MTT需求无菌，MTT对菌很活络;往96孔板加时不避光也没有联络，究竟时刻较短，或许你不放心的时分能够把操作台上的照明灯关掉.
制作MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方：Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
通常MTT法试验进程：
1：接种细胞：用含10% 胎小牛血清 得培育液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培育细胞：同通常培育条件，培育3-5天(可依据试验目的和需求挑选培育时刻)。
3：呈色：培育3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS制作，pH=7.4)20ul.持续孵育4 h，
连续培育，留神吸弃孔内培育上清液，关于悬浮细胞需求离心后再吸弃孔内培育上清液。每孔加150ul DMSO，振动10min，使结晶物充沛融解。
4：比色：挑选490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记载作用，以时刻为横坐标，吸光值为纵坐标制作细胞生长曲线。
药物MTT法试验进程
贴壁细胞：
1: 搜集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔参加100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-10000 孔，(边际孔用无菌PBS填充)。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),参加浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时刻，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.通常5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.主张设5个，不然难以反响真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下查询。
4: 每孔参加20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，持续培育4h。若药物与MTT能够反响，可先离心后弃去培育液，留神用PBS冲2-3遍后，再参加含MTT的培育液。
5: 连续培育，留神吸去孔内培育液。
6: 每孔参加150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振动10min，使结晶物充沛溶解。在酶联免疫检查仪OD490nm处丈量各孔的吸光值。
7: 一起设置调零孔(培育基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜)。
悬浮细胞：
1: 搜集对数期细胞，调度细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640(无血清)培育基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培育液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻觅稀释度，1:10-1:20);③需检查物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul参加到96孔板(边际孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下查询。
3: 每孔参加10 ul MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，持续培育4 h。(悬浮细胞推荐运用WST-1，培育4 h后可越过进程4)，直接酶联免疫检查仪OD570nm(630nm校准)丈量各孔的吸光值)
4、离心(1000转x10min)，留神吸掉上清，每孔参加100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振动10 min，使结晶物充沛溶解。在酶联免疫检查仪OD570nm(630nm校准)丈量各孔的吸光值。
5、一起设置调零孔(培育基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。
留神事项：
(1) 挑选适当得细胞接种浓度。
(2) 防止血清干扰：通常选小于10%的胎牛血清的培育液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内剩下培育液。
(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培育液的空白对照。其他试验进程保持一致，究竟比色以空白调零。
(4) MTT试验吸光度究竟要在0-0.7之间，超出这个方案就不是直线联络。
(5) 用96孔板培育细胞做MTT测细胞生机,应当加多少1640培育基,多少MTT和DMSO适合依据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培育液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
(6) 通常每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，留神不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振动10分钟，然后测吸光值。
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