生物实验中细胞融合前准备

一、骨髓瘤细胞系的选择

    骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系有P3/X63-Ag8（X63）、P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）、P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul）、SP2/0-Ag14（SP2/0）、F0、S194/5.XXO.BU.1、MPC11-45.6TG1.7、210.RCY3.Ag1.2.3、GM15006TG-A12及U-266AR等。

    骨髓瘤细胞可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基进行培养。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，zui大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮*进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

　  在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节均需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量一般为2×104或105细胞/孔。

二、细胞融合的步骤

    细胞融合一般包括制备饲养细胞层、制备免疫脾细胞、制备骨髓瘤细胞及融合等四个步骤。

    制备饲养细胞层时一般选用小鼠腹腔巨噬细胞，与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周后拉颈处死；浸泡在75%酒精内，3～5min后用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用*注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200rpm分离5～6min后，用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml，进行培养。

　　制备免疫脾细胞时先将zui后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗 一次后，将脾脏研碎，过不锈钢筛网后离心，细胞用培养液洗2次，计数后取108脾淋巴细胞悬液备用。

　　制备骨髓瘤细胞时应取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次，计数后取1×107细胞备用

　　融合时先将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不*培养液洗1次，离心后弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。在90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的不*培养液以终止PEG作用。离心弃上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。