通达仪表水环境污染生物监测，测试法

利用生物受到污染物危害或毒害后所产生的反应或生理机能的变化来评价水体污染状况，确定毒物安全浓度的方法称为生物测试法。该方法有静水式生物测试和流水式生物测试两种。前者是把受试生物放于不流动的试验溶液中，测定污染物的浓度与生物中毒反应之间的关系，从而确定污染物的毒性；后者把受试生物放于连续或间歇流动的试验溶液中，测定污染物浓度与生物反应之间的关系。测试分为短期(不超过96h)的急性毒性试验和长期(如数月或数年)的慢性毒性试验。在一个试验装置内，测试生物可以是一种，也可以是多种。测试工作可在实验室内进行，也可在野外污染水体中进行。

1、水生生物毒性试验

进行水生生物毒性试验可用鱼类、溞类、藻类等，其中鱼类毒性试验应用较广泛。

鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定浓度或强度时，就会引起系列中毒反应。例如：行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变，直至死亡。鱼类毒性试验的主要目的是寻找某种毒物或工业废水对鱼类的半数致死浓度与安全浓度，为制定水质标准和废水排放标准提供科学依据；测试水体的污染程度和检查废水处理效果等。有时鱼类毒性试验也用于一些特殊目的，如比较不同化学物质毒性的高低，测试不同种类鱼对毒物的相对敏感性，测试环境因素对废水毒性的影响等。下面介绍静水式鱼类急性毒性试验。

（1）供试验鱼的选择和驯养。

金鱼来源方便，常用于试验。要选择无病、活泼、鱼鳍完整舒展、食欲和逆水性强、体长(不包括尾部)约3cm的同种和同龄的金鱼。选出的鱼必须先在与试验条件相似的生活条件(温度、水质等)下驯养7d以上；试验前一天停止喂食；如果在试验前四天内发生死亡现象或发病的鱼高于10％，则不能使用。

（2）试验条件选择。

每种浓度的试验溶液为一组，每组至少10条鱼。试验容器用容积约10L的玻璃缸，保证每升水中鱼质量不超过2g。

试验溶液的温度要适宜，对冷水鱼为12~28℃，对温水鱼为20～28℃。同一试验中，温度变化为±2℃；试验溶液中不能含大量耗氧物质，要有足够的溶解氧，对冷水鱼DO≥5mg／L，对温水鱼DO≥4mg／L；试验溶液的pH应为6.7～8.5，试验期间pH波动范围不得超过0.4个pH单位；硬度影响毒物毒性，一般来说，硬水可降低毒物毒性，而软水可增强毒物毒性，因此，必须注意检测试验溶液的硬度，并在报告中注明。硬度应为50～250mg／L(以CaCO₃计)。

配制试验溶液和驯养鱼用的水应是未受污染的河水或湖水。如果使用自来水，必须经充分曝气才能使用。不宜使用蒸馏水。

（3）试验步骤。

①预试验(探索性试验)：为保证正式试验顺利进行，须经探索性试验确定试验溶液的浓度范围，即通过观察24h(或48h)鱼类中毒的反应和死亡情况，找出不发生死亡、全部死亡和部分死亡的浓度。

②试验溶液浓度设计：合理设计试验溶液浓度，是试验成功的重要保证，通常选7个浓度(至少5个)，浓度间隔取等对数间距，例如：10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(对数间距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(对数间距0.1)，其单位可用体积分数(如废水)或质量浓度(mg／L)表示。另设一对照组，对照组在试验期间鱼死亡率超过10％，则整个试验结果不能采用。

③试验：将试验用鱼分别放人盛有不同浓度溶液和对照水的玻璃缸中，并记录时间。前8h要连续观察和记录试验情况，如果正常，继续观察，记录24h、48h和96h鱼的中毒症状和死亡情况，供判定毒物或工业废水的毒性。

④毒性判定：半数致死量(LD₅₀)或半数致死浓度(LC₅₀)是评价毒物毒性的主要指标之一。

求LC₅₀的简便方法是将试验用鱼死亡半数以上和半数以下的数据与相应试验溶液毒物(或废水)浓度绘于半对数坐标纸上(对数坐标表示毒物浓度，算术坐标表示死亡率)，用直线内插法求出。将三种试验时间试验鱼死亡半数以上和半数以下接近半数的死亡率数值与相应废水浓度数值的坐标交点标出，并分别连接起来，再由50％死亡率处引一横坐标的垂线，与上述三线相交，由三交点分别向纵坐标作垂线，垂线与纵坐标的交点处浓度即为LC₅₀，可见24h、48h和96h的LC50分别为5.2％、4.7％、4.4％。

⑤鱼类毒性试验的应用：鱼类毒性试验的一个重要目的是根据试验数据估算毒物的安全浓度，为制定有毒物质在水中的zui高允许浓度提供依据。

目前应用比较普遍的是后一种。对易分解、积累少的化学物质一般选用的系数为0.05～0.1，对稳定的、能在鱼体内高积累的化学物质，一般选用的系数为0.01～0.05。

按公式计算出安全浓度后，要进一步做验证试验，特别是具有挥发性和不稳定性的毒物或废水，应当用恒流装置进行长时间(如一个月或几个月)的验证试验，并设对照组进行比较，如发现有中毒症状，则应降低毒物或废水浓度再进行试验，直到确认某浓度对鱼是安全的，即可定为安全浓度。此外，在验证试验过程中必须投喂饵料。

2、发光细菌法

（1）方法原理

发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性微生物，它们在适当的条件下能发射出肉眼可见的蓝绿色光（450~490nm）。当样品毒性组分与发光细菌接触时，可影响或干扰细菌的新陈代谢，使细菌的发光强度下降或不发光。在一定毒物浓度范围内，有毒物质浓度与发光强度成负相关线性关系，因而可使用生物发光光度计测定水样的相对发光强度来监测有毒物质的浓度。

国家标准（GB/T 15441——1995）中，以lu化汞作为参比毒性表征废水或可溶性化学物质的毒性，也可用半数有效浓度（EC₅₀），即发光强度为zui大发光强度一半时的废水浓度或可溶性化学物质的浓度来表征；选用明亮发光杆菌T₃亚种作为发光细菌。因该菌是一种海洋细菌，故水样和参比毒物溶液应含有一定浓度的lu化钠。

目前，常采用新鲜发光细菌培养法和冷冻干燥发光菌粉制剂法。

（2）测定要点

①试验材料的准备：生物毒性测试仪，发光细菌琼脂培养液，液体培养基，0.02~0.24mg/L系列HgCl₂标准溶液，新鲜明亮发光杆菌T₃亚种或明亮发光杆菌冻干粉，化学毒物或综合废水等。

②新鲜发光细菌悬液的制备：从明亮发光杆菌的菌种斜管面中挑取一环细菌接种于新的发光细菌琼脂斜面上，待斜面长满菌苔并明显发光时加入适量稀释液并制成菌悬液；取0.1mL菌悬液接种于50mL液体培养基中，在22℃摇床震荡培养至对数生长中期（12~14h），用稀释液将菌悬液稀释成5×10⁷个（细胞）/[mL（菌悬液）]，置于4℃下保存备用。

③样品测定：将过滤去除颗粒物杂质的待测水样加入占水样质量3％的NaCl，依次加入稀释液和待测水样，恒温（20±0.5）℃后加入等量发光细菌悬液，依次测其发光强度。

④测试结果分析：根据测得的待测水样的发光强度计算其相对折光率。

3、致突变和致癌物检测

致突变和致癌物也称诱变剂，其检测方法有微核测定法、艾姆斯(Ames)试验法、染色体畸变试验法等。

微核测定法原理基于：生物细胞中的染色体在复制过程中常会发生一些断裂，在正常情况下，这些断裂绝大多数能自行愈合，但如果受到外界诱变剂的作用，就会产生一些游离染色体断片，形成包膜，变成大小不等的小球体(微核)，其数量与外界诱变剂强度成正比，可用于评价环境污染水平和对生物的危害程度。该方法所用生物材料可以是植物或动物组织或细胞。植物广泛应用紫露草和蚕豆根尖。紫露草以其花粉母细胞在减数分裂过程中的染色体作为诱变剂的攻击目标，把四分体中形成的微核数作为染色体受到损伤的指标，评价受危害程度。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量多，对诱变剂反应敏感。

Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测被检物是否具有致突变性。这种菌株均含有控制组氨酸合成的基因，在不含组氨酸的培养基中不能生长，但如果存在致突变物时，便作用于菌株的DNA，使其特定部位发生基因突变而回复为野生型菌株，能在无组氨酸的培养基中生长。考虑到许多物质是在体内经代谢活化后才显示出致突变性的，Ames等人采用了在体外加入哺乳动物肝微粒体酶系统(简称s一9混合液)使被检物活化的方法，提高了试验的可靠性。

色体畸变试验是依据生物细胞在诱变剂的作用下，其染色体数目和结构发生变化，如染色单体断裂、染色单体互换等，以此检测诱变剂及其强度。