上海晶抗生物工程有限公司
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阅读：79发布时间：2017-7-5
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PCR试验要注意以下几点：
引物规划可能是PCR扩增成功zui要害的要素。如引物规划欠佳，可能致使扩增产品缺乏，乃至扩增失利，其原因是规划欠佳的引物可致使非特异扩增和/或构成引物二聚体，此又成为PCR反响的竞争性产品，然后进一步抑制PCR产品构成。
在引物规划时有必要思考以下几个要素，其间zui主要的是引物长度、溶解温度（Tm）、特异性、引物序列互补疑问、G/C含量和多嘧啶（T,C）或多嘌呤（A,G）延伸、3’-结尾序列等。
（1）引物长度：因为PCR反响的特异性、退火温度以及时刻均zui少有些与PCR引物长度相关联，因而引物长度是PCR扩增是不是成功要害的要素。通常PCR引物长度为15-30核苷酸。
（2）引物序列互补：规划引物时应肯定没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这么具有自我配对的区域，“弹回”即有些双链构造将发作在退火反响时。
（3）G/C含量和多嘧啶（T,C）或多嘌呤（A,G）延伸：待挑选的引物序列应尽可能是碱基随意散布，G+C含量均匀-防止长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量通常为45％-55％。在挑选的引物序列中应没有多G或多C延伸，因其可推进非特异性退火，多A和多T延伸也应防止，因其可“呼吸”和使引物－模板复合物展开延伸，下降扩增的功率。同时多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也应被防止。
（4）溶解温度（Tm）：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度（Tm）即指派一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式核算：Tm＝2（A+T）+4（G+C）。
需注意PCR反响zui少有两个（一对）引物，两个寡核苷酸引物Tm值应对比接近，不可区别过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反响温度时可发作错配，而引物Tm值较低，反响温度较高时则可能不能发作效果，因而如引物的Tm值区别较大，可致使PCR扩增功率低下乃至扩增失利。
（5）3’-结尾序列：为操控引物错配，应仔细地断定PCR引物中3’结尾的方位。
言而总之，应注重PCR引物规划，规划PCR引物时应仔细当心。关于一个成功的PCR来说，几个主要要素如引物长度、GC含量和3’序列有必要优化。抱负的引物应为差不多随意散布的核苷酸混合、GC含量50％、长度约为20个碱基，因而能使Tm值处于56-62ºC规模。剖析靶基因潜在引物位点时，应思考无单聚合体,没有显着的二级构造构成的倾向，不自我互补，与其他双链靶基因序列没有显着的同源性。为防止枯燥无味的规划，节省时刻，削减错误，可应用核算机程序优化规划、挑选、断定寡核苷酸引物。
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