流感病毒N1亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）反应流程常规程序

流感病毒N1亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）反应流程常规程序:

将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

2．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

3．反应时间

变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

4．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。

平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不ce底。

5．PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

次亚麻酸甲酯/γ-亚麻酸甲酯/次亚麻酸子甲酯/次亚麻子油酸甲酯/(顺,顺,顺)-6,9,12-十八碳三烯酸/γ-6,9,12-十八碳三烯酸甲酯/γ-Linolenic acid methyl esterFGC，98.5%5毫升EMK原装

亚麻酸甲酯/顺-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯/9,12,15-十八碳三烯酸甲酯/(顺,顺,顺)-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯/Methyl linolenateAR，70%10毫升国产/进口

1，2-丙二醇/1,2-二羟基丙烷/甲基乙二醇/丙二醇/1,2-PropanediolAR，99%500毫升国产/进口

戊二醛/1，5-戊二醛/GlutaraldehydeBR，25-28%100毫升国产

多聚甲醛/聚合甲醛/仲甲醛/固体甲醛/ParaformaldehydeCP，94%，500克国产/进口

DL-酒石酸/葡萄酸/消旋酒石酸/二羟基丁二酸/外消旋酒石酸/二羟基琥珀酸/酒石酸/(R*,R*)-(±)-2,3-二羟基丁二酸/DL-2,3-二羟基丁二酸/DL-(-)-酒石酸/(2R,3R)-2,3-二羟基, 1,4丁二酸/DL-Tartaric acidAR，99%100克国产/进口

D-酒石酸/右旋酒石酸/2,3-二羟基丁二酸/葡萄酸/二羟基琥珀酸/D-2,3-二羟基琥珀酸/D-2,3-二羟基丁二酸/D-Tartaric acidAR，99%100克国产/进口

顺-15-二十四碳单烯酸/神经酸/顺-15-二十四碳烯酸/鲨油酸/二十四烯酸/Nervonic acidBR，99%100毫克国产/进口

草酸/二水合乙二酸/蓚酸/Oxalic acid dihydrateGR，99.8%，500克国产/进口

丹宁酸/鞣酸/单宁酸/炭尼酸/没食子鞣酸/鞣质/没食子鞣酸/柔酸/单宁/二倍酸/落叶松栲胶/Tannic acidAR500克国产/进口

钼酸/Molybdic acidGR，99%100克国产/进口

硅酸/含水二氧化硅/矽酸/ Silicic acidAR500克国产/进口

硅钨酸/钨硅酸/硅钨酸水合物/Silicotungstic acid hydrateAR100克国产/进口

钨酸/Tungstic acidGR500克国产/进口

乙炔-1,2-二羧酸/丁炔二酸/乙炔二羧酸/2-丁炔二酸/2-Butynedioic acidBR，97%，5克进分

α-溴异丁酸/2-溴-2-甲基丙酸/2-溴异丁酸/α-溴代异丁酸/α-Bromoisobutyric acidBR，98%，25克国产

1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/EDC•HC1/EDAC•HC1特纯，99%1、10、25、100克国产/进口