大鼠核转录因子（NF-κB）ELISA检测试剂盒使用说明书

大鼠核转录因子（NF-κB）ELISA检测试剂盒试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制 
96/48人份酶标板 1块板（96T） 半块板（48T） 即用型 
塑料膜板盖 1块 半块 即用型 
标准品：8.0umol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按说明书进行稀稀 
空白对照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型 
标准品稀释缓冲液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型 
生物素标记的抗NF-κB抗体 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 
亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型 
洗涤缓冲液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按说明书进行稀释 
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 
终止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型 
标本稀释液 1瓶（12ml） 1瓶（6.0ml） 即用型

安全性

避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

大鼠核转录因子（NF-κB）ELISA检测试剂盒操作注意事项
试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法
血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
组织匀浆-----将组织加入适量盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液
保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
8.0 umol/L （6号标准品） 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。 
4.0 umol/L （5号标准品） 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液 
2.0 umol/L （4号标准品） 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液 
1.0 umol/L （3号标准品） 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液 
0.5 umol/L （2号标准品） 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液 
0.25 umol/L （1号标准品） 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液 
0 umol/L （空白对照） 原始浓度不用稀释直接加入50ul。

洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
大鼠核转录因子（NF-κB）ELISA检测试剂盒操作步骤
使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
在450nm波长处测定各孔的OD值。