急性肝胰腺坏死（AHPND）荧光 PCR 检测试剂盒说明书

1、 急性肝胰腺坏死(AHPND)荧光PCR检测试剂盒简介 
货号：HB-809-3 
为了适应虾急性肝胰腺坏死(AHPND)快速检测和疫病研究的需要，本公司根据 OIE 手册中提供的
参考序列和信息并在其基础上优化改进，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、
灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
2、试剂盒组成 
试剂盒组成包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂，具体组成参见表 1：
表 1：试剂盒组成（50test/盒）
组成成分 体积
样品 DNA 提取液 1
样品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
AHPND 荧光 PCR 反应液
Taq 酶(5U/ul)
阴性对照
AHPND 荧光阳性对照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存条件：样品 DNA 提取液 1、2 和试剂盒须在-20℃保存。 
3、样本采集，存放及运输 
3.1 样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。取组织标记后置于离心管中，按照试剂盒配套的DNA 抽提试剂操作说明提取DNA模板。
3.2存放：研磨后的样本在2 ℃-8 ℃条件下保存应不超过24 h；-70 ℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（多冻融3次）。
3.3 运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。 
4、检测步骤 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在样本处理区进行)： 
4.1.1 取 n 个 1.5ml 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数和一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分别加入待测样本和阴性对照各 100µl，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s,于 4℃～25℃条件下，12 000 r/min 离心 10 min。
4.1.3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混匀器上震荡混匀 5s,于 4℃～25℃条件下，2 000 r/min 离心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，
即为提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于-70℃冰箱内保存）。
4.2 荧光 PCR 检测 
4.2.1 急性肝胰腺坏死(AHPND)荧光PCR检测试剂盒扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 PCR 反应液、Taq 酶，2000×g 离心 5 秒钟。每个样品测试反应体系
配制见下表 2。
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 荧光 PCR 反应液 Taq 酶 合计
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加样（样本处理区进行）：
向每个荧光 PCR 管孔中各分装 15μL 的混合液，再分别加入样本 DNA 模板 10μL，盖紧管盖，
500 r/min 离心 30 s。
4.2.3 PCR 检测（在检测区进行）：
循环条件设置：
*阶段，95℃/3 min；
第二阶段，95℃/15 sec，60℃/1 min，40 个循环；在第二阶段每次循环的退火延伸时收集荧
光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值判定结果。
5、结果判定 
5.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样
品扩增曲线的高点为准。
5.2 质控标准
5.2.1 阴性对照无 Ct 值或无扩增曲线。
5.2.2 阳性对照的 Ct 值应<25.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
5.3 结果描述及判定
5.3.1 阴性：无Ct值或无扩增曲线，示样品中无AHPND核酸。
5.3.2 阳性：Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在AHPND核酸。
5.3.3 有效原则：Ct>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
6、急性肝胰腺坏死(AHPND)荧光PCR检测试剂盒相关技术信息 
F：TTGGACTGTCGAACCAAACG
R：GCACCCCATTGGTATTGAATG
probe： 5’-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-3’