角质细胞无血清培养基（D-KSFM ） 返回列表页

1）将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。

2）将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至准备好的离心管内，轻轻吹打液体，使细胞均匀分散，降低DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜培养基洗管壁2次，均转移至离心管内。

4）800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的培养基，吹打制成细胞悬液。

5）将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的培养基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内培养。

6）第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜培养基以去除死细胞。继续培养，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。

放置于含有生物冰袋的保温箱中低温运输（体系中的各组分请按上述列表中的条件进行储存）

细胞复苏‌：

从液氮罐中取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴中解冻。

解冻后，将细胞转移到含有新鲜培养基的培养皿中，轻轻摇动使细胞均匀分布。

放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

‌细胞换液‌：

吸除或倒掉培养皿内的旧培养液。

加入PBS缓冲液，轻轻漂洗细胞，以去除悬浮在细胞表面的碎片，重复几次。

加入新的培养基。

‌细胞传代‌：

当细胞长到80%~90%时，进行传代。

吸除或倒掉瓶内旧培养液，加入PBS缓冲液漂洗。

加入消化液，轻轻摇动使消化液流遍所有细胞表面。

将培养瓶放入37℃培养箱中静止几分钟，观察细胞变化。当细胞间隙增大后，加入含有血清的培养液终止消化。

吹打细胞使其成为悬液，转移到离心管中离心。

弃上清，加入适量的细胞培养液重悬细胞。

按比例分装到新的培养皿中，补加新鲜培养基。

做好标记，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

‌细胞冻存‌：

选择对数生长期的细胞进行冻存。

将细胞转移到离心管中离心，弃上清。

加入适量的冻存液（如90%的培养基+10%的DMSO），轻轻吹打重悬细胞。

将细胞转移到冷冻保存管中，标记后放入程序降温盒，再放入-80℃冰箱冻存。几小时后或过夜转至液氮罐保存。