ATCC细胞传代培养之胰酶消化法

ATCC细胞传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。
而这篇文章主要介绍的是贴壁细胞的传代培养方法。
1、材料准备及实验步骤
仪器：上海力康CO2培养箱、倒置显微镜、上海力康安全柜
材料：Corning细胞培养瓶、试管、移液管、巴士德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、培养的细胞。
试剂：培养基RPMI1640(Corning10-040-CVR)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液(Corning 21-020-CVR)。
实验步骤：
① 入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;
② 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。 将培养用液37℃下预热。
③ 超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;
④ 打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气除去臭氧;
⑤ 点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
⑥ 将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
⑦ 倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
⑧ 每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
⑨ 加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
⑩ 对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
2、注意事项
① 传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。
② 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
③ 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。
3、ATCC细胞的建系和维持
细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。
对每一个细胞系来说都有其自身的特点，要做好建系的维持必须记录好细胞档案,换液传代和做好细胞系(或株)的鉴定和管理工作。
    500mg    Behenoyl Polyoxylglycerides    山嵛酰氧基聚氧甘油酯标准品
    500mg    Powdered Ginger    生姜粉标准品
    500mg    Lauroyl Polyoxylglycerides    月桂酰聚氧甘油酯标准品
    500mg    Powdered Bilberry Extract    越橘提取物标准品
301-00-8     5×50mg    Methyl Linolenate     亚麻酸甲酯标准品
112-63-0     5×50mg    Methyl Linoleate     亚油酸甲酯标准品
133107-64-9     5.97mg    Insulin Lispro    赖脯胰岛素标准品(2-8℃)
    5.25oz        " 
氟化牙粉：单氟磷酸钠(1000 ppm)/二氧化硅标准品 
 
"
    5.25oz        氟化牙粉：单氟磷酸钠(1500 ppm)/二氧化硅标准品
50-56-6     5 vials        羟可待酮标准品
9002-60-2    5 vails    Corticotropin    促肾上腺皮质激素标准品
ATCC细胞