ATCC细胞培养操作步骤

 随着分子生物学和ATCC细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。体外培养的心肌细胞可保存其结构及功能上的某些特点，具有自发性搏动，可在不受神经、体液因素的影响下，直接进行心肌细胞的生理、病理、药理、毒理及能量代谢等方面的研究以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子，心肌细胞培养有着广阔的应用前景。根据Simpon的方法并稍加改进培养乳鼠心肌细胞叙述如下：

1. 将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于 37℃水浴中温育好。

2. 解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重复以上过程。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

3. 用第二套手术器械进行下列操作。用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中，加少许 0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中，调节转速至 60 rpm左右，消化15 min(务必保证水浴温度恒定在 37℃，并且消化时间不超过 15 min)。或者，如果采用的是水浴震荡器的话，不用加搅拌子，直接放在水浴震荡器中消化亦可，转速和消化时间相同。

4 . 从水浴中取出锥形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血红细胞和成纤维类细胞。

5 . 加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液几次，机械分散细胞(组织消化后会成为粘稠的胶体状)，注意：不要过分吹打，否则会导致组织过度消化，37℃水浴搅拌再消化 10-15 min；如果乳鼠数目少(比如 5、6 只的时候)，消化时间可以减少为 5-10 min，否则很容易消化过度。上述消化处理的同时，往一支 50 ml 的一次性无菌离心管中加入 20 ml 预冷的含 10%血清的培养液，并放置冰台上。消化处理之后，小心移出上清转至上述加有培养液的离心管中，*次消化收集的分离出的细胞，*次消化结束后；继续第二次消化，余下的组织块加入 10 ml 新胰酶继续消化。

6 . 重复 2.5 消化步骤，直至剩余少许组织块为止，一般消化 4-5 次可以消化绝大多数的组织块(不含弃去消化液的那次)。

7 . 第 1、2 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心；第 3、4 次含细胞的消化液放在一根离心管中，过 180 目筛网后，一起离心。Z后，分别用 8 ml含 20%血清的培养液重悬两管细胞，接种到一个 75 cm2的塑料培养瓶中，放置在培养箱中 1.5 小时后，取出，弃贴壁细胞(主要是成纤维细胞和内皮细胞)，将未贴壁的细胞悬液取出，台盼篮拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5-6x105个/ml，接种到目的培养器皿中。

8 . 一般不用加BrdU，如果培养时间长(发现成纤维细胞也极少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纤维细胞增殖。加了BrdU，心肌细胞搏动的持续时间会更长。

9 . ATCC细胞接种后 24 小时，用温的培养基或者平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以去处未贴壁的细胞(部分细胞会在 24 小时后贴，结果很多细胞重叠生长)，再更换培养液，即可。可以按照实验需要在培养 48 h 或 72 h 后施加处理因素。
用于空肠弯曲菌的分离培养    Skirrow Agar Base Modified    250克    空肠弯曲菌琼脂基础
用于抗生素敏感试验    Mueller-Hinton Broth    250    MH 肉汤（MHB）   
用于抗生素敏感试验    Mueller-Hinton Agar    250    MH 琼脂（MHA）   
用于抗菌素药物敏感性试验    MHB    250克    MH肉汤
用于菌苗及生物制品霉菌无菌检验    Martin Broth ,Modified    250    改良马丁液体培养基   
用于军团菌的选择性分离培养(OXOID方法)    BCYE Agar(Legionella Agar)    250    BCYE 琼脂(Legionella 琼脂)
用于金黄色葡萄球菌凝固酶试验    Rabbit  Plasma    0.5ml*20    兔血浆  
用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。每100ml培养基需另加入1%亚碲酸钠1ml    Sodium lurite Broth Base    250    亚碲酸钠肉汤培养基基础   
用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。每100ml培养基需另加入1%亚碲酸钠0.2ml    Beisachang Sodium lurite Broth Base    250    北沙参亚碲酸钠胨水培养基基础
ATCC细胞