1、 虾白尾病（WTD）荧光 RT-PCR 检测试剂盒（MrNV）简介
货号：HB-810-1
虾白尾病（White tail disease，WTD）也称为白肌肉病（White muscle disease，WMD）或罗
氏沼虾肌肉白浊病（Macrobrachium rosenbergii Whitish muscle disease）,主要在亚洲和南美洲北部流行。其主要病原为罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），
研究发现感染对虾中还存在另外一种超小型病毒（Extra small virus，XSV），为 MrNV 的微型病毒。
虾感染后腹部、尾部出现白色浑浊，zui终可扩散全身肌肉，死亡率可达 95%以上。
为了适应虾白尾病快速检测和疫病研究的需要，本公司参考 2016 年 OIE 水生动物疾病诊断手册
2.2.7 中*的的引物和探针序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒
进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
2、 试剂盒组成
试剂盒组成包括核酸扩增试剂。具体组成参见表 1：
表 1：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
WTD-MrNV 荧光 RT-PCR 反应液
酶混合物
阴性对照
WTD-MrNV 荧光阳性对照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生产的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取试剂盒》）
3、 样本采集,存放及运输
3.1 样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。随机取5只-10只新鲜的虾作为采样标本，采
集的部位包括：虾头部的眼柄、肝胰腺、头腹部肌肉或腹肢等（可部分或全部采集这些组织）。详
见相关标准。
3.2 存放：研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可*保存，但应避
免反复冻融（zui多冻融 3 次）。
3.3 运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。
4、 荧光 RT-PCR 检测
4.1 操作方法
4.1.1 样本的处理（在样本制备区进行）：
4.1.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出），做标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需
提取核酸)
4.1.1.2 虾白尾病（WTD）荧光 RT-PCR 检测试剂盒（MrNV）每管加入 600 L 裂解液，分别加入被检样本和阴性对照各 200 L，一份样本换用一个吸头，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用
手颠倒混匀），于 4℃ 12 000 r/min 离心 15 min。
4.1.1.3 取与 4.1.1.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 L 异丙醇（-20℃预冷），做标记。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500L，不能吸出中间层，颠倒混匀。
4.1.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 L 75％
乙醇，颠倒洗涤。
4.1.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
4.1.1.6 4 000 r/min 离心 10s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要
碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.1.7 加入 11 L DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需*保存须放置-70 ℃冰箱内。
【也可参照《病毒 RNA 柱式提取试剂盒说明书》（货号：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需*保存须放置-70 ℃冰箱内。
4.1.2 检测
4.1.2.1 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物，在室温下融化后，2000 r/min 离心 5 s。
设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表 2：
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个
荧光RT-PCR管中各分装16 L，转移至样本处理区。
4.1.2.2 加样（样本处理区进行）：
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4.1.1.7中制备的RNA溶液各10 L，盖紧
管盖，500 r/min离心30 s。
4.1.2.3 荧光 RT-PCR 检测（在检测区进行）：
将4.1.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
虾白尾病（WTD）荧光 RT-PCR 检测试剂盒（MrNV）循环条件设置：
*阶段：42oC /60 min；
第二阶段：95oC /10 min；
第三阶段：95oC /15 sec, 58 oC /30 sec，40个循环，在58 oC的退火延伸时收集荧光。
