小鼠垂体瘤细胞具体步骤

小鼠垂体瘤细胞具体步骤

1. 水：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.

2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-hanks液的配制)：

主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗

溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。

移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

3. *溶液：

*的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对*的作用反应不一样。*分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，*溶液的作用能力zui强。使用*时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低*的活性，所以配制*溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者*抑制剂终止*对细胞的作用。

称取*：按*液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

用注射滤器抽滤消毒：配好的*溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

4. 0.05%*-0.02%EDTA溶液

称取*粉末(1：250) 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于-20℃保存。

5. 青、*溶液：

所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。*是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。*是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中，使青*的浓度zui终为100单位/ml。

6. RPMI1640：

溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青*液各0.5ml, 使青*的浓度zui终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或*调PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，摇匀。

安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

使用前要向100ml培养液中加入1ml*溶液(4℃时两周有效)。

7. 血清的灭活：

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

8. HEPES溶液：

HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。