猴B疱疹病毒荧光定量 PCR 检测试剂盒使用方法解析

 猴B疱疹病毒荧光定量 PCR 检测试剂盒使用方法

一、样品 DNA 的制备

1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 DNAout。

二、引物的制备（在样品制备室进行）

2.按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水（加入量见引物试管上的标签），使得两条引物的浓度均为 10 μM（10 pmol/μL），然后各取 50 μL混合在一起，标注为引物混合物，放冰上待用。

三、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，

因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成

分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，

  猴B疱疹病毒荧光定量 PCR 检测试剂盒(染料法)

 Herpesvirus simiae qPCR Kit（Dye based）                                     CAT#:11-180703

只提供可以直接使用的长为 124bp 的 DNA 段作为阳性对照。3. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

4.用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（用带芯枪头，下同）。

5.先将本试剂盒提供的阳性对照用超纯水 10 倍梯度稀释到 10E8 拷贝/μL。放冰上待用。

6.在 7 号管中加入 5 μL 10E8 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

8.换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5 拷贝/ μL 的阳性对照。放冰上待用。

9.换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，得 10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

三、设置 PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10.在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

成分 样品 阴性对照 阳性对照（2-7 管）

2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 各 10 μL

引物混合物 2 μL 2 μL 各 2 μL自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

待测样品 DNA 模板 1-5 μL 不加 不加

各 5μL（2 号样到阳性对照（2-7 号） 不加 不加 2 号管，3 号样到 3

号管…）

补水到 20 μL 20 μL 20 μL

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行

优化）。

过程 温度 时间

预变性 95℃ 5 分钟

PCR 反应

（40 个循环） 95℃ 15 秒

60℃ 60 秒

12.数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时， 大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的大吸收光谱在 500 nm，大发射光谱在 530 nm。

四、数据处理

13.以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品

浓度的 log 和标准曲线计算出样品 DNA 的浓度。

 产品保存 低温运输，-20℃保存